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ATP生物发光法评价餐饮具的微生物污染研究

文档作者：张凤兰，徐潇，王海燕，高飞单纯，崔生辉文档来源：中国食品药品检定研究院		点击数：	更新时间： 2025年06月08日
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上一篇： HACCP体系在校园餐饮安全中的应用

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第7卷第3期
2016年3月
食品安全质量检测学报、，01．7 NO．3
Journal ofFood Salty and Quality Mar,，2016
ATP生物发光法评价餐饮具的微生物污染研究
张凤兰，徐潇，王海燕，高飞，单纯，崔生辉+
(中国食品药品检定研究院，北京100050)
摘要：目的对ATP生物发光法与平板计数法在评价餐饮具微生物污染的检出限及检出率进行评价，并对2
种方法的相关性进行研究。方法应用3家国内公司生产的ATP生物发光检测仪，分别对不同浓度的ATP标
准溶液检测并绘制标准曲线：以不同浓度的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌液及人工接种大肠杆菌的餐饮具作为
被检品，分别应用ATP生物发光法和平板计数法进行检测，绘制ATP生物发光法对大肠杆菌、金黄色葡萄球
菌检测的标准曲线，并对2种检测方法在人工污染餐饮具检测的相关性绘制曲线。结果3家公司的ATP生物
发光检测仪对ATP标准溶液、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检出限差异较大；但在某一检测范围内，3家公司ATP
生物发光检测仪的检测RLU值与ATP标准溶液、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌量均有良好的线性相关性。3家公
司ATP生物发光检测仪对人工接种大肠杆菌餐饮具的检测显示，ATP生物发光法与平板计数法有良好的线性相关
性。结论3家公司的ATP生物发光法对ATP、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检出限存在不同检测仪的仪器误
差，且差异较大，目前，ATP生物发光法不能替代传统的平板计数法来评价餐饮具的微生物污染状况。
关键词：ATP生物发光法；平板计数法：餐饮具；微生物
Evaluation of microorganism on tableware by ATP bioluminescence
ZHANG Feng—Lan，XU Xiao，WANG Hai．Yan，GAO Fei，SHAN Chun，CUI Sheng—Hui+
(National Institutionsfo，Food and Drug Control，Beoing 1 00050，China)
ABSTRACT：Objeetive To evaluate the detection 1imit and detection rate of the ATP bioluminescent
method and the plate count method for tableware microbial contamination．and investi譬ate the correlation
be觚een the 2 methods．Methods The standard solution with different concentrations were detected by the
different ATP bioluminescent detectors produced by domestic companies(A，B，and C，respectively)and the
standard curve was drawn after detection．Using different concentrations of Escherichia coli,Staphylococcus
aureus bacteria liquid and artificial inoculation of E．coli tableware as goods．the ATP bioluminescence detector
and the plate count method were used to detect them respectively，and then the standard curve of detection
value between the 2 methods for quantity of Escherichia coli，slaphylococcus aureus and tableware in artificial
pollution and the correlation curve were drawn between the 2 methods．Results The detection limit of ATP
standard solution．Escherichia coli and Staphy’lococcus aureus were different among the 3 kinds of ATP
bioluminescence detectors from different companies；but while in a detection range．the 3 kinds of different
ATP bioluminescence detectors had a good linear correlation．And the 2 different methods have a good 1inear
correlation．Conclusion There is an obvious instrument error between the difierent detectors from 3
companies on the detection limit for Escherichia coli and Staphylococcus aureus．And the difierence iS obvious．
+通讯作者：崔生辉，博士，研究员，主要研究方向为食品微生物。E-mail：cuishenghui@aliyun．tom
+CorrespoⅡdiⅡg author：CUI Sheng-Hui，Professor，National Institutions for Food and Drug Control，No．2 Tiantan Xili，Beijing 100050，China．
E—mail：cuishenghui@aliyun．corn
万方数据
912 食品安全质量检测学报第7卷
therefore，the ATP bioluminescent method cannot replace the traditional plate count method for evaluating the
microbial contamination condition of tableware at present．
KEY WORDS：ATP bioluminescence；plate counting；tableware；microorganism
1 引言
餐饮具洁净度检测是监控餐饮食品污染的一道
重要程序，《食品安全法》中要求餐饮具在使用前应
当彻底洗净并消毒⋯。餐饮具的污染主要来自微生
物、食物残渣或油脂等，微生物污染一直是餐饮具洁
净度监控中的首要目标群。传统的平板计数法是检测
微生物污染的“金标准”，但因其检测周期长，不能进
行实时监控，在监管工作中受到了限制。目前，ATP
生物发光法作为一种快速检测方法，已初步用于食
品生产过程、厨房、冰箱、铁路站车食品器具及餐饮
具等处的清洁度检测[2。6】。
ATP(adenosine triphosphate)即三磷酸腺苷，是微
生物能量的主要载体，存在于所有动植物细胞中。
ATP生物发光法的基本原理就是通过裂解破坏细胞
壁将ATP释放出来，在M92+存在时，ATP在荧光素酶
和D．荧光素的作用下，使ATP释放磷酸基团并同时
发出荧光，然后通过检测相对荧光强度(relative light
unit，RED)推算餐(饮)具被细菌、食物残渣等污染的程
度。反应式如下所示。D．刘笛蓁+御岭等oXy_黼A舢Pi+H20
Omidbakhsh等[J7】曾对国外4个不同品牌的ATP
生物发光检测仪的灵敏度进行对比研究，发现不同
品牌的仪器间的灵敏度存在较大差异。本研究首次对
我国不同品牌的3款ATP生物发光检测仪，对ATP
标准溶液、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检出限进行
评价，并在餐饮具表面细菌的检出效率方面与传统
的平板计数法[B1进行相关性研究，以确定ATP生物发
光法是否能够替代传统的平板计数法来评价餐饮具
表面的微生物污染状况。
2材料与方法
2．1菌株与试剂
标准菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC29213)和大肠
杆菌(ATCC25922)(美国菌种保藏中心ATCC)。三磷
酸腺苷二钠(ATE美国Sigma公司1。
2．2仪器与设备
ATP生物发光检测仪(含有本公司配套的擦拭
子)：A、B、C公司为我国国产公司，A和B公司生产
手持式ATP生物发光检测仪，C公司为便携式ATP生
物发光检测系统；培养箱(美国Thermo公司)；离心
机(美国Thermo公司)。
2．3实验方法
2．3．1 ATP生物发光检测仪的ATP标准曲线建立
用高压灭菌的去离子水配制浓度为10。2mol／L的
ATP溶液，并用去离子水按照1：10、1：100进行倍比
稀释。从浓度为10。4、10‘1 3一⋯．和10’5mol／L的ATP
溶液中各取10 pL(A和B公司)或50 txL(C公司)JJHA
到拭子上，应用生物发光检测仪测定其RLU值
∽=3)。溶剂(去离子水)作为空白对照组。以ATP含
量的对数值为横坐标，以生物发光检测仪的测量值
RLU的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。
2．3．2 ATP生物发光检测仪的细菌量标准曲线建立
将新鲜培养的大肠杆菌(ATCC25922)和金黄色
葡萄球菌(ATCC29213)接种于无菌的胰蛋白胨大豆
肉汤培养基(TSB)，37℃培养20 h后，3000 r／min离
心10 min，弃上清：用无菌0．85％的生理盐水重悬沉
淀，3000 r／min离心1 0 min，弃上清，重复上述操作一
次。最后，用0．85％的无菌生理盐水重悬沉淀，并对
菌液浓度进行调节，使其100倍稀释菌液浊度为1．0
MCF，而后用0．85％的生理盐水按1：10、1：102、1：103、
1：104、1：105进行倍比稀释。
按照食品安全国家标准GB 4789．2—2010【8】方法
检测上述菌液浓度，同时操作空白对照组(0．85％的
无菌生理盐水)。取不同浓度的菌液各10 IxL(A和B
公司)或50 I．tL(C公司)加入到ATP生物发光检测仪的
擦拭子上，测其RLU值仞=3)。同时操作空白对照组
(0．85％的无菌生理盐水)。
以细菌数量(CFU)的对数值为横坐标，以ATP测
量值RLU的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。
2．3．3 餐(饮)具人工污染样品的检测
取洗净的瓷盘120个，在瓷盘中央画出4个5 cm
x5 cm的正方形，每两个正方形之间彼此隔开。160cC
万方数据
第3期张凤兰，等：ATP生物发光法评价餐饮具的微生物污染研究913
烘烤4 h灭菌备用。
将120个瓷盘分5组进行染菌，每组染菌24个
瓷盘：包括用不同浓度菌悬液(5个浓度，每个浓度染
4个瓷盘)染菌及4个空白对照(0．85％的生理盐水)瓷
盘。具体染菌方式如下：将2．3．2中1：10、1：102、1：103、
1：104、1：105稀释的大肠杆菌(ATCC25922)菌悬液各
取20皿，缓慢均匀加入到每个瓷盘的25 cm2正方形
中间，每个瓷盘的4个正方形均染相同浓度的大肠杆
菌。而后将这24个瓷盘进行盲法编号备用。
取盲法编号的染菌瓷盘，用棉签蘸取o．85％的
生理盐水，从每个瓷盘上的其中一个25 cm2正方
形方格中涂抹回收细菌，按食品安全国家标准GB
4789．2．2010方法检测细菌数量。在读取菌落总数
结果时，为方便结果的对数转换统计，如果平板上
未见菌落生长，则该平板菌落数记为1 CFU。分别
用3个公司的ATP生物发光检测仪对编号的染菌
瓷盘中每个25 cm2正方形中的大肠杆菌进行快速
检测。
按照样品编号，以细菌数量(CFU)的对数值为横
坐标，以ATP测量值RLU的对数值为纵坐标，做剂
量反应曲线。
3结果与分析
3．1 ATP生物发光法的标准曲线
A、B和C公司的ATP生物发光检测仪对ATP
标准溶液的检出限分别为：1、10、0．5 fmol(1
fmol=10J5m01)(表1)，在10‘14mol与104mol浓度问，
ATP含量的对数值与RLU的对数值间均有良好的线
性关系，线性相关系数都在0．95以上。见图1。
41．A公司-B公司▲C公司
图I ATP生物发光法的标准曲线
Fig．1 Standard curve ofATP bioluminescence
3．2 ATP生物发光方法与大肠杆菌量的标准曲线
A、B和C公司的ATP生物发光检测仪对大肠
杆菌的检出限分别为：1．47x104、1．47x103、7．35×101
CFU(表1)。大肠杆菌含量在1．47x104CFU与1．47x108
CFU间，3家公司的ATP生物发光检测仪的RLU对
数值与细菌量对数值间均有良好的线性关系，线性
相关系数均在0．94以上。见图2。
0 l 2 3 4 5 6 7 8 9 10
大肠杆菌量对数值(Log(CFU))
图2 ATP生物发光方法与大肠杆菌量的标准曲线
Fig．2 Standard curve ofATP bioluminescence and the
amount ofE coli
3．3 ATP生物发光方法与金黄色葡萄球菌量
的标准曲线
A、B和C公司的ATP生物发光检测仪对金黄
色葡萄球菌的检出限分别为：1．55x105、I．55x104、
7．75x101 CFU(表1)。金黄色葡萄球菌含量在1．55x105
CFU与1．55×108CFU间，3家公司的ATP生物发光检
测仪的RLU对数值与细菌量对数值间均有良好的线
性关系，线性相关系数均在0．98以上。见图3。
0
3
宙
苟
3
道
巅
翟
邋
掣
划
靛
晕
金黄色葡萄球菌量对数值(Log(CFU))
图3 ATP生物发光方法与金黄色葡萄球菌量的标准曲线
Fig．3 Standard curve of A=rP bioluminescence and the
amount ofS aureus
9
8
7
6
5
4
3
一3邑s01)靼蒜安靼装《霞霹 2●O
7
6
5
4
3
一3一邑暑01)靼辍萤迥装越莨罂 2●n
万方数据
914 食品安全质量检测学报第7卷
表1 ATP生物发光检测仪对ATP标准溶液、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检出限
Table 1 The detection limit ofATP standard solution．E．coli and s．aureus by ATP meter
3．4 ATP生物发光法与平板计数法的相关性
对人工污染不同浓度大肠杆菌的瓷盘进行检测，
接种最低浓度大肠杆菌的瓷盘表面按食品安全国家
标准GB 4789．2．2010方法回收的菌量为2．95x102
CFU，接种最高浓度大肠杆菌的回收菌量为1．Oxl05
CFU。B公司和C公司的ATP生物发光仪均能检测
到瓷盘上最低浓度组的2．95x 102 CFU大肠杆菌：而
A公司的ATP生物发光仪不能检测到瓷盘上的
2．95x102 CFU大肠杆菌，能检测较高浓度组瓷盘上
的1．55x103 CFU大肠杆菌。在平板计数法回收的大
肠杆菌2．95x102CFU与1．0×105CFU浓度间，用3家
公司的ATP生物发光检测仪所得的RLU对数值与用
平板计数法对大肠杆菌计数的对数值间均有良好的
线性关系，线性相关系数均在o．93以上。见图4。
叠
3
蛊
苟三
趔
籁
靛
趔
架
划
霞
罂
◆A公司一B公司▲C公司
图4 ATP生物发光法与平板计数法的线性相关图
Fig．4 Linear correlation ofATP bioluminescence method
and plate counting method
4结论与讨论
本研究中，从我国市场上抽取的3家国产公司的
ATP生物发光检测仪的结构和功能都存在差异。A公
司和B公司的ATP生物发光检测仪均为手持式，轻
巧便携，拭子插入反应液中，很快就能读数，最大读
数均为9999；C公司为ATP生物发光检测系统，携带
不便，需逐步加入反应试剂，读数较慢，最大读数为
106，最低检测体积为50 pL，而不是10此。A、B、
C公司检测仪对ATP标准溶液的检出限均低于10
fmol，在10 fmol与106 fmol浓度间，ATP含量的对数
值与RLU对数值间的线性相关系数均在0．95以上，
与文献报道的研究结果一致19,101。
A、B、C公司检测仪对大肠杆菌的检出限均低
于金黄色葡萄球菌，其中c公司的检测仪灵敏度最
好，比B和C公司的低2—3个Log。但在检测范围内，
ATP的检测值与细菌量间均有良好的线性相关性。
Omidbakhsh等[_7】曾对国外4个不同品牌的ATP生物
发光检测仪的灵敏度进行对比研究，对金黄色葡萄
球菌的检出限也相差3个Log。这可能与不同公司使
用的擦拭子、ATP提取剂、M92+浓度、荧光素酶活
性等存在差异有关，对细菌ATP提取效果不同，ATP
反应的条件存在差异，导致不同仪器的灵敏度存在
差别【ll-15]。
Turnertl0J用Charm Sciences公司生产的
novaLUM生物发光检测仪对金黄色葡萄球菌的检出
限为102 CFU，但Omidbaldash等[7】应用Charm
Sciences公司对金黄色葡萄球菌的检出限为105
CFU。同一家公司的检测仪对金黄色葡萄球菌的检出
限存在差异可能与细菌处于不同的生长状态有关，
Turner等检测的是对数生长期的金黄色葡萄球菌，此
时细菌细胞中的ATP含量较高，而Omidbakhsh等检
测的是处于静止期的金黄色葡萄球菌，此时细胞分
裂后消耗ATP,细菌细胞内的ATP含量较少。本研究
检测的也是生长处于静止期的大肠杆菌和金黄色葡
萄球菌，检出限较高。
为评价生物发光检测仪是否能够实际反映餐饮
具微生物污染的状况，本研究在瓷盘上人工污染大
肠杆菌，分别应用3家公司的仪器与平板计数法同时
进行检测。结果显示，2家公司的ATP生物发光检测
万方数据
第3期张凤兰，等：ATP生物发光法评价餐饮具的微生物污染研究915
仪均能检测到2．95x 102 CFU的大肠杆菌，1家公司
能检测到1．55x103 CFU大肠杆菌，3家公司的检测
值与平板计数法的线性相关系数均高于0．93。文献
报道，在我国曾利用ATP生物发光仪对餐饮具进
行过检测，与传统平板计数法的检验结果差异无
统计学意义⋯61。
但在实际检测餐饮具时，微生物可能会处于“饥
饿状态”，被命名为“VBNC(viable but not culturable)”．
此时，仅有l／100的细菌能够培养，并且细菌细胞内
所含ATP的量较少，此时，ATP生物发光法的检测值
会低于实际的微生物量[9,171；但当有食物残渣和体液
及脱屑的细胞污染时，ATP检测值就要高于实际的微
生物含量【l引。此外，ATP检测值还受到化学消毒剂或
洗涤剂的影响【71。在检测人工污染的大肠杆菌时，因
接种大肠杆菌的程序复杂，大肠杆菌对湿度的要求
较高，使大肠杆菌的接种回收率较低(实验数据未公
布)。而此时大肠杆菌中的ATP含量可能仍处于较高
状态，因此，A和B公司的生物发光检测仪对餐饮具
上大肠杆菌的检出限低于对菌液的检出限。
ATP生物发光检测仪在对餐饮具进行实时监
控方面能够发挥重要作用，但不同仪器间的性能
存在较大差异，并且其检测值受到诸多因素的影
响，很难制定统一的标准。因此，在目前情况下，
ATP生物发光法还不能替代食品安全国家标准GB
4789．2．2010中的传统平板计数法来评价餐饮具的
微生物污染状况。
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(责任编辑：杨翠娜)
／
张凤兰，博士，副研究员，主要研究方
向为食品化妆品安全性评价。
E-mail：flzhan92007@163．com
崔生辉，博士，研究员，主要研究方向
为食品微生物。
E—mail：cuishenghui@aliyun．tom

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