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化学发光生物传感器法测定食品中有机磷与氨基甲酸酯类农药残留

文档作者：王晓朋1, 曾梅1, 万德慧1, 唐晗1, 赵彬媛2, 周雅倩2, 刘晓宇1, 2* 文档来源： 1. 华中农业大学食品科技学院 2. 环境食品学教育部重点实验室,		点击数：	更新时间： 2025年06月24日
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上一篇：黄曲霉毒素危害和检测方法研究进展

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第5 卷 第12 期 食品安全质量检测学报 Vol. 5 No. 12
2014 年12 月 Journal of Food Safety and Quality Dec. , 2014
基金项目: 华中农业大学国家级大学生创新创业训练计划项目(20130504035)
Fund: Supported by the National Undergraduate Training Programs for Innovation and Entrepreneurship of Huazhong Agricultural University
(20130504035)
通讯作者: 刘晓宇, 博士, 教授, 博士生导师, 主要研究方向为食品安全与农业资源综合利用。E-mail: liuxiaoyu@mail.hzau.edu.cn
*Corresponding author: LIU Xiao-Yu, Professor, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070,
China. E-mail: liuxiaoyu@mail.hzau.edu.cn
化学发光生物传感器法测定食品中有机磷与氨基
甲酸酯类农药残留
王晓朋1, 曾 梅1, 万德慧1, 唐 晗1, 赵彬媛2, 周雅倩2, 刘晓宇1, 2*
(1. 华中农业大学食品科技学院, 武汉 430070; 2. 环境食品学教育部重点实验室, 武汉 430070)
摘要: 目的构建一种用于检测食品中有机磷与氨基甲酸酯类农药残留的高灵敏度生物传感器, 建立一种
用于测定食品中两类农药残留的新方法。方法以固定化乙酰胆碱酯酶(AChE)为识别元件与底物碘化硫代乙
酰胆碱(ATCI)特异性反应, 采用微流控芯片与化学发光仪作为检测元件, 以鲁米诺与铁氰化钾作为化学发光体
系, 通过流动注射分析法来检测农药残留。结果当有机磷类农药辛硫磷、敌敌畏、乐果浓度范围分别在
0.1~10、0.08~10、0.8~15 μg/mL 时, 相关系数分别为0.9923、0.9903、0.9904, 检出限分别为0.047、0.054、0.388
μg/mL; 当氨基甲酸酯类农药克百威、西维因、灭多威浓度分别在0.08~15、0.1~10、0.1~10 μg/mL 时, 相关系
数分别为0.9926、0.9972、0.9944, 检出限分别为0.049、0.051、0.080 μg/mL。传感器性能评价实验结果显示,
在最佳条件下对辛硫磷、敌敌畏、乐果、克百威、西维因、灭多威分别测定6 次, 结果RSD 值均小于7%, 精
密度较好; 以碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)为底物, 连续通入鲁米诺与铁氰化钾化学发光体系6 次, 所得RSD 值小
于8%, 稳定性较好; 将实验制备的固定化AchE 储存于pH 值为8.0 的磷酸盐缓冲溶液中, 每隔10 d 测一次化
学发光峰值, 结果显示两个月内相对活力下降为23%, 保存时间较长; 将传感器用于测定包菜、苹果样品中的
农残, 添加回收率在90%~99%之间, 显示精密度较好, 可用于测定食品中的农药残留量。结论此生物传感器
性能良好, 适用于测定食品中的有机磷与氨基甲酸酯类农残。
关键词: 有机磷; 氨基甲酸酯; 乙酰胆碱酯酶; 微流控芯片; 化学发光; 生物传感器
Determination of organophosphorus and carbamates pesticide residues in
foods by chemiluminescence biosensor
WANG Xiao-Peng1, ZENG Mei1, WAN De-Hui1, TANG Han1, ZHAO Bin-Yuan2,
ZHOU Ya-Qian2, LIU Xiao-Yu1,2*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;
2. Key laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministry of Education, Wuhan 430070, China)
ABSTRACT: Objective To create a high-sensitivity biosensor for detecting organophosphorus and carbamates
pesticides in foods and establish a new method to determine these two kinds of pesticides. Methods
Immobilized acetylcholinesterase (AchE) was used as recognition element of the sensor, reacting specifically
with the substrate of acetylthiocholine iodide(ATCI), the micro-fluidic chip with CL analyzer was used as
4164 食品安全质量检测学报 第5 卷
detecting element, and luminol-potassium ferricyanide system was used in chemiluminescence system.
Results When the concentration of proximal, dichlorvos, dimethoate ranging from 0.1~10, 0.08~10, and
0.8~15 μg/mL, respectively, the correlation coefficients were 0.9923, 0.9903, and 0.9904, and the detection
limits were 0.047, 0.054, and 0.388 μg/mL, respectively. When the concentrations of carbofuran, carbonyl, and
methomyl were ranging from 0.08~15, 0.1~10, and 0.1~10 μg/mL, respectively, the correlation coefficients
were 0.9926, 0.9972, and 0.9944, and the detection limits were 0.049, 0.051, and 0.080 μg/mL, respectively.
The evaluation of biosensor performance indicates good precision, when determining all 6 kinds of pesticides
under optimal conditions, RSD was below 7%; when the substrate of ATCI was injected into
chemiluminescence system 6 times discontinuously, RSD was below 8%, which indicated good stability;
immobilized AChE was stored in phosphate buffer(pH=8.0), detecting activity every 10 d, lasting for two
months, the relative enzymatic activity decreased only 23%, indicating a good storage stability; the biosensor
was used to detect samples of cabbage and apple, fortified recoveries were between 90%~99%. Conclusion
This biosensor has a good performance, therefore it can be used to determine pesticides in foods.
KEY WORDS: organophosphorus; carbamates; acetylcholinesterase; micro-fluidic chip; chemiluminescene;
biosensor
1 引 言
农药的应用对于我国农业的发展发挥了巨大的
作用, 有机磷与氨基甲酸酯类农药是其中的重要组
成部分。但是农药滥用的同时也对环境及人体带来了
无法避免的危害。有机磷及氨基甲酸酯类农药俗称
“神经毒剂”, 能与人体兴奋传导物质乙酰胆碱的分
解酶乙酰胆碱酯酶特异性结合, 使人痉挛, 严重则会
导致死亡[1]。因此, 国家标准规定了农药使用的限量
标准[2], 而为了执行这些标准, 就必须有与之对应的
检测方法来测定农药残留, 以判断农药是否超标。
现行的农药残留测定方法有气相色谱质谱联用
技术、高效液相色谱法、波谱法等[3,4], 但这些方法如
高效液相色谱法, 前处理较复杂, 专业性较强, 设备
成本昂贵, 无法满足现场检测、快速检测的目的。此
外还有免疫分析法、酶抑制率法、速测卡法[5-7]等快
速检测方法, 也存在对有机磷农药敏感性差、性质不
稳定的缺点。而应用生物传感器[8]能够弥补上述方法
无法满足的现场、快速检测的需求。据文献报道[9,10],
酶生物传感器对有机磷与氨基甲酸酯类农药的检测
有较好的重现性与稳定性。本研究将化学发光与固定
化乙酰胆碱酯酶[11,12]生物传感器结合, 旨在构建一
种快速检测有机磷与氨基甲酸酯类农药的残留的新
方法。
生物传感器由识别元件、转换元件及检测元件构
成, 由识别元件承担特异性识别及反应工作, 之后经
换能元件将生化信号转化为可识别的电信号, 以达
到检测的目的[13,14]。与传统方法相比, 生物传感器有
灵敏度高、选择性好、分析速度快的特点[15]。
2 材料与方法
2.1 仪器与试剂
BPCL 微弱化学发光仪(中国科学院生物物理所);
HL-2 恒流泵(上海沪西分析仪器厂有限公司); 超声
波清洗器SB-3200DT(宁波新芝生物科技股份公司);
组织捣碎机(PHILIPS); 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪
器厂); AB204-E 电子分析天平(上海天平仪器厂); 722
可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司); HH-4 恒
温水浴(国贸电器有限公司); AB204-E 电子分析天平
(上海天平仪器厂); DF-101S 集热式恒温加热磁力搅
拌器(武汉科尔仪器设备有限公司)。
碘化硫代乙酰胆碱(ATCI, 纯度99%, Sigma 公
司); 电鳗乙酰胆碱酯酶(AChE, Sigma 公司); 壳聚糖
(250g, 脱乙酰度96%, 分子量30 万, 浙江金壳生物
化学有限公司); 铁氰化钾(500g, 纯度≥99.0%, 天津
市塘沽区德华化学试剂); 鲁米诺(1g, 纯度99%, 美
国Sigma 公司); 解磷定(2-PAM, 25 g,纯度99%, 美国
Sigma 公司); 敌敌畏标液(100 μg/mL, 农业部环境保
护科研监测所研制); 辛硫磷标液(100 μg/mL, 农业
部环境保护科研监测所研制); 乐果标液(100 μg/mL,
农业部环境保护科研监测所研制); 西维因标液(100
μg/mL, 农业部环境保护科研监测所研制); 克百威
第12 期 王晓朋, 等: 化学发光生物传感器法测定食品中有机磷与氨基甲酸酯类农药残留 4165
标液(100 μg/mL, 农业部环境保护科研监测所研制);
灭多威标液(100 μg/mL, 农业部环境保护科研监测所
研制); 实验用蔬菜均购自华中农业大学集贸市场。
2.2 实验方法
2.2.1 芯片设计
微流控芯片是用于制作芯片的材料单晶硅、无定
形硅、玻璃、金属和有机聚合物如环氧树脂、聚甲基
丙烯酸甲脂(PMMA)、聚碳酸脂(PC)、和聚二甲基硅
氧烷(PDMS)等, 采用微细加工技术在芯片上构建由
微通道、微反应室、储液池等功能单元构成的微流路
系统[16,17]。高分子聚合物材料种类多, 加工成型方便,
价格便宜, 尤其是高聚物材料有良好的光学性质、化
学惰性、电绝缘性和热性能等, 使其在微流控芯片领
域的应用具有得天独厚的优势[18]。近年来高聚物为
材料的芯片应用广泛。
本研究以具有良好的综合力学性能的高分子聚
合物聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为原料, 采用铣床刻
蚀法刻蚀微通道。研究采用溶剂键合法键合芯片, 用
二氯乙烷和异丙醇(1:1, v:v)键合, 在显微镜下观察键
合效果, 键合的微流控芯片平整光滑, 沟道通畅, 无
阻塞现象。且向微通道里注入品红溶液, 结果溶液在
通道里流动顺畅, 显微镜下观察发现通道边沿无渗
漏。微流控芯片如图1 所示(单位: mm)。
图1 聚甲基丙烯酸甲酯流通池示意图
Fig. 1 Schematic diagram of polymethyl methacrylate
flow cell
2.2.2 化学发光生物传感器流路设计
传感器主要包括固定化酶柱和化学发光仪, 其
他辅助装置包括蠕动泵、八通阀、及微机等(如图2)。
a: PBS; b: 碘化硫代胆碱底物溶液; c: 恢复剂2-PAM; d: 样品; e:
铁氰化钾溶液; f: 鲁米诺溶液; G 为八通阀; ER: 酶柱; P1、P2: 第1、
2 恒流泵; PMT: 光电倍增管; NHV: 负高压; W: 废液; PC: 计算机。
图 2 化学发光生物传感器流路图
Fig. 2 The flow analysis system of chemiluminescence
biosensor
2.2.3 化学发光生物传感器使用流程
首先进行生物传感器操作条件优化, 在最优条
件下进行农药浓度检测。传感器的具体操作步骤如下:
1) 基线: 调节化学发光仪的负高压为400 V, 开
启恒流泵P1、P2, 使pH 为8.0 的磷酸盐缓冲溶液a、
3 mmol/L 铁氰化钾溶液e 和0.6 mmol/L 鲁米诺溶液
f 分别通过管道, 直到基线稳定, 记录发光强度为I;
2) 基础酶活的测定: 旋转八通阀G, 用0.05
mmol/L 的底物溶液b 替代磷酸盐缓冲溶液a 通入管
路, 通入时间为70 s, 然后将三通阀重新转回原来的
位置, 停止注入ATCh 的底物溶液, 通入磷酸盐缓冲
溶液a, 记录化学发光强度最低值I0, 即初始酶活;
3) 剩余酶活的测定: 待基线回到原发光强度后,
停止恒流泵P2, 调整八通阀, 停止注入磷酸盐缓冲
溶液a, 通入样品溶液d, 注入时间为20 min, 然后调
整八通阀G, 通入磷酸盐缓冲溶液a, 以去除样品溶
液。开启泵P2, 重复步骤2)记录的化学发光强度最
低值Ii, 即为剩余酶活性;
4) 酶活恢复: 停止恒流泵P2, 调整八通阀G,
使浓度为1 mmol/L 恢复剂2-PAM 溶液c 过酶反应器,
持续15 min, 旋转八通阀, 通入磷酸盐缓冲溶液a 5
min, 以去除2-PAM 溶液;
5) 复活后的酶活测定: 开启恒流泵P2, 重复步
骤2)记录化学发光最低值Ij, Ij-I 为相对化学发光强度
值, 选取发光强度最大, 发光值波动最小为最佳发光
条件;
6) 待检测结束后用清水冲洗管道。
2.2.4 农药的测定
固定化酶的抑制效果用农药样品溶液通过酶反
应器前后的酶活差值Ii-I0 占基础酶活I-I0 的百分比表
4166 食品安全质量检测学报 第5 卷
示。其抑制率计算公式如下:
i 0
j 0
(%) 100
I I
I I
―
＝ ×
―
抑制率 (1)
0
(%) j 100 I I
I I
―
＝ ×
―
恢复率
(2)
其中I 为基线化学发光强度; I0 为未通入农药时
的化学发光强度; Ii 为通入农药后的化学发光强度; Ij
为通入恢复剂后的化学发光强度。
2.2.5 乙酰胆碱酯酶的固定及性能优化
根据文献[19-21], 并加以改正。首先配制18 mL 浓
度为5%的壳聚糖溶液(2.5％的乙酸溶液), 在锥形瓶
中加入50 mL 液体石蜡, 并加入1.5 mL 分散剂
Span-80, 在一定转速下, 逐滴加入壳聚糖溶液, 继
续高速搅拌使溶液液滴分散均匀, 然后逐滴加入0.8
mL 的戊二醛溶液(体积浓度为25%), 40 ℃水浴加热
交联反应lh。反应结束后, 使之与2.5 mol/LNaOH:
无水乙醇(v:v=l:1)溶液混合震荡, 之后静置, 去除油
层和水层, 用去离子水多次洗涤到中性, 最后将制得
的微球于4 ℃冰箱存放。
称取0.500 g 壳聚糖微球加入2.0 mL 浓度为
0.4% GA 溶液充分震荡15 min, 然后用蒸馏水反复
冲洗以除去多余的戊二醛溶液。称取0.500 g 经活化
后的微球, 加入1.2 U 的酶液, 4 ℃振荡20 h, 用
PBS( 0.1 mol/L, pH7.5) 冲洗抽滤以除去表面吸附的
游离酶, 在4℃的PBS 中保存备用。在此条件下测得酶
活回收率为75.35%, 连续测定6 次, RSD 值为5.76%。
参考Ellman[22]的方法, 并加以改善。移取3
mLPBS 溶液(0.1moL/L , pH=8.0)和0.015 g 固定化酶
于10 mL 比色管中, 混匀。30 ℃水浴30 min 后, 依
次加入100 μL DTNB (20 mmol/L)和20 μL ATCh (100
mmol/L), 混匀, 412 nm 处比色。静置1min 后迅速读
出吸光度, 取出比色皿慢慢摇动, 混匀反应体系, 每
隔1 min 读数, 连续测定5 min。酶活力(U/g)用每g
酶溶液每1 min 水解底物的μmol 数表征。
U[μmol/(min·mg)]=V×A/(K×L×m)
式中:
V—反应体系的总体积(mL);
A—吸光度随时间的变化率(1/min);
L—测定酶活力时溶液的光径长度, 即比色皿光
程(mm), L=10;
K—消光系数[L/(mmol·mm)], K=1.36;
m—称取的固定化酶的质量(g)。
2.2.6 酶柱制备
将含有固定化酶的缓冲溶液摇匀, 用胶头滴管
(酶活力在1 U 左右)吸取酶液, 加到4 cm×4 mm(i.d.)
的短塑料玻璃管中, 玻璃短管两端拉成1 mm(i.d.)的
尖口。两端用粘有筛绢(孔径为0.05 mm)的带孔橡皮
塞封住, 制得固定化酶柱。
2.2.7 样品前处理
擦去样品(包菜、苹果)表面泥土, 取代表性可食
部分, 用组织捣碎机捣碎, 取样品5 g, 置于50 mL烧
杯中, 加10 mL 丙酮超声5 min, 不停振摇, 收集滤液;
然后向烧杯中再加入10 mL 丙酮, 振摇3 min, 合并滤
液, 移入装有5 g 无水硫酸钠的玻璃漏斗中, 吹干丙酮,
向离心管中加入10 mL 的磷酸盐缓冲溶液(0.01 mol/L、
pH8), 取10 mL 上清液用微孔过滤器过滤后待用。
3 结果与分析
3.1 化学发光生物传感器条件优化
3.1.1 鲁米诺浓度的影响
鲁米诺作为发光剂, 直接影响着化学发光体系。本
研究考察了浓度为0.2~1.0 mmol/L的鲁米诺溶液, 化学
发光趋势如图3 所示: 随着鲁米诺浓度的增大, 相对化
学发光强度呈增大趋势。但是噪声很大, 信噪比降低,
同时浓度为0.6 mmol/L时便可满足测量所需的发光值。
综合考虑以上因素, 选取鲁米诺浓度为0.6 mmol/L。
图3 鲁米诺浓度对相对化学发光强度的影响(n=3)
Fig. 3 The effect of luminol concentrations on relative
chemiluminescence intensity(n=3)
3.1.2 铁氰化钾浓度的影响
铁氰化钾在碱性条件下可氧化鲁米诺产生化学
发光, 是影响化学发光体系的重要因素。本研究在
pH 值与鲁米诺浓度一定的条件下, 考察了浓度为
第12 期 王晓朋, 等: 化学发光生物传感器法测定食品中有机磷与氨基甲酸酯类农药残留 4167
1~6 mmol/L 铁氰化钾溶液, 化学发光趋势如图所示:
在浓度为3 mmol/L 时达到最大化学发光值, 故选择
铁氰化钾的浓度为3 mmol/L。
图4 铁氰化钾浓度对相对化学发光强度的影响(n=3)
Fig. 4 The effect of potassium ferricyanide concentration on
relative chemiluminescence intensity (n=3)
3.1.3 流速的影响
在化学发光微流动注射体系中, 试剂混合和反
应速度迅速, 因此必须选择合适的流速, 保证试剂能
够充分混合并能获得较高的化学发光强度。流速太快
样品来不及混合反应, 不能有效地采集反应信号, 并
且流路压力过大, 易造成管路泄露; 流速太慢不易形
成连续的流体。
本研究考察了0.20~0.45 mL/min 的流速情况下
的发光趋势, 如图5 所示: 随着流速的增大, 相对化
学发光强度不断增大, 基线达到平衡的时间逐渐延
长。但是随着流速的增加, 化学发光的值波动较大,
泵压也相应增加。综合考虑达到平衡所需时间, 以及
实验所需发光强度, 选择流速为0.40 mL/min。
图5 恒流泵流速对相对化学发光强的的影响(n=3)
Fig. 5 The effect of constant-flow pump speed on relative
chemiluminescence intensity(n=3)
3.1.4 底物浓度的影响
底物硫代乙酰胆碱对化学发光强度影响很大。本
实验考察了0~100 mmol/L 浓度条件下底物对化学发
光强度的影响。结果如图6 所示, 底物浓度在0~20
mmol/L 范围内, 化学发光强度随着底物浓度的增加而
急剧上升; 而当底物浓度大于20 mmol/L 后, 吸光度积
分值趋于平缓。所以选择底物最佳浓度为20 mmol/L。
图6 底物浓度对化学发光强度变化值的影响(n=3)
Fig. 6 The effect of substrate concentration on
chemiluminescence intensity(n=3)
3.1.5 底物与酶接触时间的影响
在一定范围内, 底物与酶作用的时间越长, 生
物传感器显示化学发光强度变化越明显。但由于有机
磷和氨基甲酸酯类农药是底物竞争性抑制剂, 将影
响农药对酶抑制程度的准确性。
本实验研究了底物浓度为20 mmol/L 时与酶作
用20~120 s 时间范围内对化学发光强度的影响。从
图7 所示, 作用时间在20~100 s 范围内, 化学发光值
逐渐增强, 当超过70 s 后, 化学发光强度变化缓慢,
并且化学发光积分值峰形变得钝和宽, 出现拖尾现
象。所以选择最佳的酶与底物的接触时间为70 s 作
为后续的研究。
3.1.6 农药抑制时间的影响
乙酰胆碱酯酶与有机磷或氨基甲酸酯类农药的
反应, 类似于酶与底物的反应。首先二者形成酶-农
药复合物, 随后农药的酰基转移到酶活性中心丝氨
酸上的羟基使酶丧失活性, 从而使酶-受到抑制。农
药对乙酰胆碱酯酶的抑制时间不同, 生物传感器的
响应值变化也不同。
本研究选用1 μg/mL 的敌敌畏标准溶液考察了
4168 食品安全质量检测学报 第5 卷
5~30 min 抑制时间内, 生物传感器响应值的变化, 趋
势图如图8 所示: 在5~20 min 时间范围内, 随着农药
与酶反应器接触时间的延长, 酶活受抑制的程度不
断增强, 当抑制时间大于20 min 时, 酶活抑制率虽
然还有上升趋势, 但是变化幅度较小。因此, 本研究
最终选择20 min 作为农药抑制时间。
图7 底物与酶接触时间对化学发光强度变化值的影响(n=3)
Fig. 7 The effect of substrate contacting time on
chemiluminescence intensity (n=3)
图8 农药抑制时间对酶活力的影响(n=3)
Fig. 8 The effect of inhibition time on inhibition rate(n=3)
3.1.7 恢复时间的影响
有报道[23]发现3 种肟类化合物对辛硫磷抑制乙
酰胆碱酯酶具有重活化作用。目前常用的重活化剂多
为肟类化合物, 如氯磷定、双复磷、甲磺磷定、双磷
定等。本研究区采用碘解磷定(2-PAM)作为乙酰胆碱
酯酶的复活剂, 选用1 μg/mL 的敌敌畏溶液作用酶反
应器20 min 后, 研究1 mmol/L 2-PAM 对酶活恢复的
最佳时间。研究考察了5~30 min 恢复时间对传感器
化学发光强度的影响, 结果如图9 所示: 当2-PAM溶
液的作用时间等于或大于15 min 时, 受到抑制的固定
化酶的活力可以恢复到初始酶活的87%以上, 延长恢
复时间可以更好地恢复酶活, 但综合考虑检测时间和
恢复率等因素, 确定恢复时间为15 min 比较合适。
图9 恢复时间对酶活恢复率的影响(n=3)
Fig. 9 The effect of recovery time on recovery rate(n=3)
3.2 标准曲线的建立
分别配制浓度为0.1~10 μg/mL 的辛硫磷标准溶
液, 浓度为0.08~10 μg/mL的敌敌畏标准溶液, 浓度为
0.8~15 μg/mL 的乐果标准溶液, 浓度为0.08~15 μg/mL
的克百威标准溶液, 浓度为0.1~10 μg/mL 西维因标准
溶液, 浓度为0.1~10 μg/mL 的灭多威标准溶液。
在最佳条件下测定化学发光值, 取农药的对数
浓度(μg/mL)为横坐标, 酶活抑制率(%)为纵坐标, 做
线性回归方程, 并计算线性相关系数; 以酶活抑制率
为5%作为检出限, 结果如表1 所示。
3.3 精密度实验
在最佳条件下对含有辛硫磷、敌敌畏、乐果、克
百威、西维因、灭多威的溶液分别测定6 次, 如表2
所示, 其RSD 均小于7%, 可见所研制的传感器具有
较好的精密度。
3.4 稳定性实验
在没有农药抑制的条件下, 向传感器连续6 次流
动注射底物ATCh (0.05 mmol/L, 40 s), 所得到的峰值
见图10。由图可知, 虽然传感器的基线随着注射次数
第12 期 王晓朋, 等: 化学发光生物传感器法测定食品中有机磷与氨基甲酸酯类农药残留 4169
的增加而产生一定的漂移, 但是传感器对底物的响
应较好(RSD=7.75%, n=6), 表现出良好的稳定性。
3.5 酶柱保存稳定性
将固定化酶保存在4 ℃, 含0.02% NaN3、浓度
为0.1 mol/L, pH=8.0 的磷酸盐缓冲液中, 每10 d 测定
一次化学发光值, 持续两个月, 结果见图11。固定化
酶的活力在整个保存期内(60 d)稍有下降, 与原酶活
相比, 2 个月内仅降低了23%。
3.6 样品检测及添加回收率
取包菜、苹果样品各三份, 分为三组, 分别向包
菜样品中添加不同量的辛硫磷标品, 分别为加标前
辛硫磷含量的80%、100%、120%; 向苹果样品中添
表1 农药的线性相关方程、相关系数与检出限
Table 1 Regression equation, correlation coefficient and limit of detection of pesticides
种类 线性范围(μg/mL) 线性方程 相关系数(R²) 检出限(μg/mL)
辛硫磷 0.1~10 Y = 10.366X + 18.995 0.9923 0.047
敌敌畏 0.08~10 Y = 16.22X + 25.614 0.9903 0.054
乐果 0.8~15 Y = 7.2755X + 8.0116 0.9904 0.388
克百威 0.08~15 Y = 19.843X + 31.059 0.9926 0.049
西维因 0.1~10 Y = 16.22X + 25.614 0.9972 0.051
灭多威 0.1~10 Y = 12.001X + 18.182 0.9944 0.080
表2 精密度实验结果
Table 2 The results of precision experiment
农药
检测次数(μg/mL) RSD值(%)
1 2 3 4 5 6
辛硫磷 1.982 2.071 2.032 2.206 2.301 1.871 6.897
敌敌畏 1.117 1.172 1.093 1.106 1.038 1.002 5.539
乐果 2.212 2.082 2.193 1.926 2.036 2.124 4.628
克百威 1.024 1.041 1.074 1.176 1.137 1.021 5.435
西维因 1.087 1.106 1.171 1.038 0.965 1.026 6.577
灭多威 1.106 1.047 1.175 1.098 1.037 1.041 4.520
图10 多次注射底物ATCh 后传感器的响应值
Fig. 10 Responses of the biosensor to repeated injection of ATCh
图11 传感器化学发光强度随时间的变化(n=3)
Fig. 11 The stability of microfluidic biosensor(n=3)
4170 食品安全质量检测学报 第5 卷
表3 农药在包菜、苹果中的添加回收率与相对标准偏差
Table3 Pesticides recoveries and relative standard deviation in cabbage, apple
样品 农药种类 加标前量±SD 值 (μg/g) 加标量 (μg/g) 期望值 (μg/g) 测量值±SD 值 (μg/g) 回收率±SD (n=3)
包菜 辛硫磷
1.297±0.04 1.000 2.297 2.194±0.101 0.900±0.084
1.297±0.04 1.300 2.597 2.477±0.104 0.909±0.083
1.297±0.04 1.560 2.857 2.743±0.115 0.929±0.072
苹果 西维因
2.31±0.066 1.800 4.110 4.071±0.049 0.982±0.033
2.31±0.066 2.260 4.570 4.512±0.154 0.977±0.073
2.31±0.066 2.600 4.910 4.827±0.093 0.971±0.036
加不同量的西维因标品, 分别为加标前含量的80%、
100%、120%, 1 h 后按2.2.7 方法处理, 用所建立的生
物传感器在最优测定条件下进行测定。选用辛硫磷标
准曲线对包菜中的辛硫磷含量与加标回收率进行计
算, 选用西维因标准曲线对苹果中的西维因含量与
加标回收率进行计算, 结果如表3 所示, 可以看出各
个样品回收率均大于90%, 在90%~99%之间, 平均
偏差≤8.5%, 具有较好的回收率, 表明此方法对检
测包菜、苹果中的有机磷及氨基甲酸酯类农药残留检
测结果较为准确。
4 结 论
本研究构建了微流控芯片与固定化酶柱结合的
化学发光生物传感器法测定有机磷与氨基甲酸酯农
药残留的新方法。同时建立了辛硫磷、敌敌畏、乐果、
克百威、西维因、灭多威的标准曲线。当农药残留浓
度在一定范围内时, 化学发光值与农药对数浓度有
良好的线性关系(R²>0.99), 辛硫磷检测范围为
0.1~10 μg/mL, 检出限为0.047 μg/mL; 敌敌畏检测
范围为0.08~10 μg/mL, 检出限为0.054 μg/mL; 乐果
检测范围为0.8~15 μg/mL, 检出限为0.388 μg/mL;
克百威检测范围为0.08~15 μg/mL, 检出限为0.049
μg/mL; 西维因检测范围为0.1~10 μg/mL, 检出限为
0.051 μg/mL; 灭多威检测范围为0.1~10 μg/mL, 检
出限为0.080 μg/mL, 研究扩大了检测的线性范围,
为农药残留的检测提供了一种新思路。
同时, 本研究对传感器的性能进行了评价, 测试
指标有精密度、稳定性、加标回收率、酶柱保存活性
等。实验证明, 此生物传感器有着良好的性能, 适用
于农药残留的快速分析, 具有操作简单、效率高、工
作量小的特点。此外该方法检出限小于我国相关标准
规定的蔬菜、水果中农药最高残留限量(MRL)值(0.2
mg/kg 和0.5 mg/kg)的要求, 因此本法完全满足对蔬
菜、水果中有机磷和氨基甲酸酯农药残留的分析。
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(责任编辑: 杨翠娜)
作者简介
王晓朋, 本科, 主要研究方向为食品
科学与工程。
E-mail: 937530451@qq.com
刘晓宇, 博士, 教授, 博士生导师,
主要研究方向为食品安全与农业资源综合
利用。

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