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酶联免疫吸附法在食品安全性指标检测中的研究进展

文档作者：冯敏1, 2 李亚楠1, 2 高丽霞1, 2, 黄登宇2, 3 文档来源： 1. 山西大学生命科学学院 2. 山西大学食品药品快速检测中心 3. 山西省食品药品监督管理局,		点击数：	更新时间： 2025年06月30日
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第7 卷 第10 期 食品安全质量检测学报 Vol. 7 No. 10
2016 年10 月 Journal of Food Safety and Quality Oct. , 2016
*通讯作者: 黄登宇, 副教授, 主要研究方向为食品卫生检测。E-mail: Huangdy1110@126.com
*Corresponding author: HUANG Deng-Yu, Associate Professor, Shanxi University &amp;amp; Shanxi Food and Drug Administration, No.85, Longcheng
Avenue, Xiaodian District, Taiyuan 030006, China. E-mail: Huangdy1110@126.com
酶联免疫吸附法在食品安全性指标检测中的
研究进展
冯 敏1, 2, 李亚楠1, 2, 高丽霞1, 2, 黄登宇2, 3*
(1. 山西大学生命科学学院, 太原 030006; 2. 山西大学食品药品快速检测中心, 太原 030006;
3. 山西省食品药品监督管理局, 太原 030006)
摘要: 随着我国社会经济的快速发展和人们生活水平的提高, 食品安全问题日益成为人们关注的焦点。酶联
免疫吸附法是在免疫学和细胞工程学基础上发展的一种微量检测技术, 具有操作简便、灵敏度高等优点。本文
总结了酶联免疫吸附法在农药残留、兽药残留、致病微生物、生物毒素、非法添加的非食用物质、重金属、
过敏原和转基因食品等检测中的研究进展, 评价了该检测方法的优缺点, 并对其未来的发展方向进行了展望
和建议。
关键词: 酶联免疫吸附法; 抗原; 抗体; 食品安全
Research progress of enzyme-linked immunosorbent assay in food safety
indices detection
FENG Min1, 2, LI Ya-Nan1, 2, GAO Li-Xia1, 2, HUANG Deng-Yu2, 3*
(1. College ofLife Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. The Food and Drug Safety Rapid
InspectionCenter, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 3. Shanxi Food and Drug
Administration, Taiyuan 030006, China)
ABSTRACT: With the development of society and the improvement of people'sliving standards, food safety problem
has becomethe focus of the attention. Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA)is a trace detection technology
based on immunology and cell engineering, which is simple and sensitive. In the paper, the research progressofELISA
in analysis of food safetywere reviewed, including the detection of pesticide residues, veterinarydrugresidues,
pathogenic microbes, biological toxin, illegally added inedible substance, heavy metal pollution, allergen, genetically
modified food, etc. The advantages and disadvantagesof ELISA were evaluated, and its futureperspective was also
prospected and suggested.
KEY WORDS: enzyme linked immunosorbent assay;antigen; antibody; foodsafety
1 引 言
食品安全主要包括食品卫生安全、食品供应质量安全
和食品供应总量安全[1]。针对食品安全问题, 检测技术的
开发是当今迫切需要解决的技术壁垒[2]。目前常用的食品
安全质量检测技术包括色谱、质谱技术、光谱分析法、生
物检测技术等[3],这些方法检测时间长、仪器昂贵、操作复
杂, 不能满足快速检测的要求[4,5]。20 世纪70 年代, Engval
万方数据
3974 食品安全质量检测学报 第7 卷
等[6]建立了酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent
assay, ELISA)定量测定lgG 的方法, 该方法具有干扰性小、
灵敏度高、操作快捷、污染小、安全性高等特点, 被广泛
用于食品安全检测。ELISA 分类标准不统一, 但可根据试
剂来源、标本性状及检测条件等将现有的检测技术分为夹
心法、间接法、竞争法和捕获法4 种方法[7]。
2 ELISA 在食品安全性指标检测中的应用
2.1 农药残留检测
每年我国都会发生因食用农药残留超标的蔬菜而引
起人畜中毒的事件, 另外在蔬菜的出口贸易中也存在因农
药残留超标而使贸易受阻的问题。农药残留对我国蔬菜产
品的质量和人民的饮食安全都有重要的影响[8]。农药残留
常用的快速检测方法有酶抑制法和ELISA[9]。果蔬中的有
机磷和氨基甲酸酯类农药的酶抑制率检测方法比较成熟,
但需要注意的是, 样品取样的规范操作及取样部位会影响
检测的准确度, 酶试剂易失活导致反应不稳定, 检测结果
误差较大, 重复性差[10]。ELISA 操作步骤简便, 适用于样
品量较大的分析筛选,但是ELISA 受限于抗体和抗原制备
和提取[11,12]。
Otieno 等[13]建立了检测毒死蜱残留的ELISA 方法,
该方法对于水和沉积物样本的检测限(limit of detection,
LOD)是0.37 μg/L 和0.42 μg/kg(干重), 平均回收率和变异
系数(coefficient of variation, CV) 分别为(96.0±5.8)% 和
(108.0±3.4)%, 与高效液相色谱法相比无显著差异
(P>0.05) 。Alexandra 等[14] 建立了检测滴滴涕
(dichlorodiphenyltrichloroethane, DDT)及其相关化合物的
ELISA 方法, 结果显示LOD 是0.06 μg/L, 线性范围为
0.1~2 μg/L, DDT 相关化合物的LOD 是0.04 μg/L, 线性范
围为0.07~1 μg/L。曾俊源等[15]建立了测定桃中氰戊菊酯直
接竞争ELISA 法, 线性范围为0.01~10 mg/L, 相对标准偏
差(RSD, n=5)为4.5%, IC50 为193 μg/L。在2、0.2 和0.05
mg/kg 添加水平下, 回收率分别为81%~89%、85%~98%和
85%~106%, RSD 分别为5.1%、5.6%和7.7%(n=5), LOD 是
0.014 mg/kg。
2.2 兽药残留检测
兽药残留包括兽药原药、兽药在动物体内的代谢物以
及与兽药有关的杂质等物质[16]。兽药残留会引起中毒, 其
次长期的兽药残留会产生耐药性的菌株, 从而提高了疾病
治疗的难度, 还会导致过敏反应, 并影响生态环境, 最终
制约畜牧业的发展[17]。兽药残留常用的方法有微生物法、
仪器分析法[18]。微生物法适用于对畜禽组织中的抗菌药物
进行筛选检验, 该方法虽然能检测高浓度的残留, 但是检
测限高于样品所规定的最高残留限量[19]。建立对兽药残留
快速检测的方法已较为紧迫, ELISA 已经成为广泛应用的
快速检测兽药残留的方法[20]。
硝基呋喃类兽药是一类人工合成的广谱抗菌药, 主
要用于预防和治疗由大肠杆菌和沙门氏菌引起的肠道感染,
主要包括呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林[21,22]。
李亚楠等[23]建立了检测动物组织中的呋喃妥因代谢物的直
接竞争化学发光酶免疫法(chemiluminescent enzyme-linked
immunoassay, CLEIA), 线性检测范围为0.030~10.595
ng/mL, IC50 为0.559 ng/mL; 鸡肉样品中的LOD 为0.015
μg/kg; 加标回收率为84.9%~103.4%, 批内CV 为
3.4%~7.8%, 批间CV 为4.7%~11.8%; 除与呋喃妥因原药
交叉反应率为36.2%, 与其他结构类似物及衍生化试剂交
叉反应率均小于0.1%。王瑞等[24]建立了检测动物组织中的
呋喃妥因代谢物的间接竞争CLEIA法, IC50为0.753 ng/mL,
在鸡肉组织中的LOD 为0.028 μg/kg, 添加回收率在
80.54%~102.64%之间, CV 均小于10%。李亚楠等[25]建立
了检测动物组织中的呋喃妥因代谢物的直接ELISA 法,线
性方程为Y=-34.723X+158.01(r2=0.9922), 线性检测范围为
0.177~11.508 ng/mL, IC50 为1.291 ng/mL; 猪肉、鸡肉、鱼
肉的LOD 分别为0.115、0.113、0.109 μg/kg, 加标回收率
在82.6%~104.7%之间, 批内CV 在3.6%~9.3%之间, 批间
CV 在4.3%~12.4%。Liu 等[26]建立了检测呋喃妥因代谢物
残留的间接竞CLEIA 法, 线性范围0.03~64 μg/L, LOD 是
0.01 μg/L, 添加回收率为92.1%~107.7%。任海涛等[27]建立
了ELISA 法检测呋喃西林代谢物, IC50 为12.37 ng/mL, 线
性范围为0.439~110.78 ng/mL, LOD 为0.07 ng/mL。闫叶娜
[28]建立了检测呋喃西林代谢物的间接竞争ELISA 法和
CLEIA 法。ELISA 最适检测范围为0.1~80 ng/mL, LOD 为
0.03 μg/L, 批内CV 和批间CV 分别为2.480%和3.385%,
IC50 为2.19 ng/mL; CLIA 的最适检测范围0.1~80
ng/mL,LOD 为0.02 μg/L, IC50 为1.85 ng/mL。李敏等[29]建
立了检测呋喃唑酮代谢物的间接竞争ELISA 法, 线性范围
为0.25~10 ng/mg, IC50 为0.5881~1.1333 ng/mL; 此外经检
测与其他类似物的交叉反应率, 特异性良好。
直接竞争CLEIA 法的灵敏度和最低检测限均优于间
接竞争CLEIA 法, 与ELISA 法相比, CLEIA 法具有更高的
灵敏度和更低的检测下限, 其灵敏度比ELISA 法高出一个
数量级左右。在操作过程中, CLEIA 法不需要长时间和较
高温度的孵育显色, 加入化学发光液后, 室温避光反应4
min 即可检测。因此, CLEIA 法在检测时间、灵敏度及最低
检测限方面表现出了较大的优越性。其中, 直接竞争
CLEIA 法的灵敏度和最低检测限又优于间接竞争CLEIA
法, 因此在实际检测和产品试剂盒的研发中, 优先选择直
接竞争CLEIA 法。
2.3 致病微生物检测
目前不论是在发展中国家还是发达国家, 对食品安
全影响较大的是致病微生物引起的食源性疾病, 而在人们
万方数据
第10 期 冯 敏, 等: 酶联免疫吸附法在食品安全性指标检测中的研究进展 3975
食物链中, 单增李斯特菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌都是重
要的食源性致病菌[30]。伍燕华等[31]建立了检测沙门氏菌的
双抗夹心ELISA 法, 该法以抗沙门氏菌多克隆抗体作为捕
获抗体, 以抗沙门氏菌单克隆抗体C1359 作为检测抗体,
对A、B、C、D、E5 种典型的沙门氏菌进行了检测, 结果
表明对沙门氏菌纯培养液的最低检测量为1×104 CFU/mL,
且无交叉反应。陈钢等[32]建立了检测单增李斯特菌的
ELISA 法, 单核细胞增生李斯特菌检测范围为108~105
CFU/mL, 该研究建立的双抗夹心检测方法与金黄色葡萄
球菌和阪崎肠杆菌有较严重的交叉反应, 而与志贺氏菌和
沙门氏菌交叉反应不明显。李建科等[33]建立了耐热菌间接
竞争ELISA 快速检测方法, LOD 为5×104 CFU/mL, 可在
24h 内给出果汁中耐热菌是否超过1 CFU/10 mL 的检测结
果, 满足国内外果汁标准中耐热菌不超过1 CFU/10 mL 的
检测结果要求, 检测时间比目前国内外普遍采用的
KFL(Krueger Food Laboratories)法缩短3~4 d, 检测结果与
KFL 法完全相符。
ELISA法由于酶的催化效率很高, 可极大放大反应效
果, 使测定方法达到较高的灵敏度[34]。但是ELISA 法常出
现假阴性结果, 这可能与所用单克隆抗体的特异性有关,
因此需要设置阳性和阴性对照试验[35]。ELISA 法与致病菌
传统检测法中的分离培养生化鉴定法相比[36], ELISA 检测
不能作为最后的确证, 因为实际情况样本分散以及样本量
不均、监管分散, 因此使用快速检测可以先对样本进行初
步筛选, 先筛选出可疑的样本, 再对可疑的样本进行分离
培养, 从而提高检测效率[37]。
2.4 生物毒素检测
检测生物毒素的方法有薄层层析法、微柱层析法、高
效液相色谱法和毛细管电泳法等。薄层层析法灵敏度低,
微柱层析法需要用其他的方法进行验证, 高效液相色谱
法要求样品的纯度比较高, 样品的前处理比较繁琐, 操
作复杂, 仪器昂贵, 毛细管电泳成本比较高[38]。近年来出
现了许多新型的检测新技术, 仪器分析法仍然是实验室
检测中最常用的方法。以免疫学为基础的方法如ELISA
法由于其具有实验周期短、设备简单、操作简便等特点而
被广泛应用[39]。
Stachowiak 等[40]建立了检测黄曲霉毒素B1 直接竞争
ELISA, 通过对单克隆抗体准确度的实验确定了两种单克
隆抗体, IC50 分别是0.037 ng/mL 和0.031 ng/mL。宋晓丽[41]
建立了检测猪肉和鸡肉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇
(deoxynivaleno, DON)和T-2 毒素的直接竞争ELISA 法, 在
猪肉和鸡肉样本中DON 的LOD 分别为34.9 μg/kg 和43.5
μg/kg, 添加回收率为72.7%~97.1%, CV<8.7%; T-2 毒素的
LOD 分别为33.7 μg/kg 和28.7 μg/kg, 添加回收率为
72.1%~95.0%, CV<11.3%。王吕等[42]建立了基于噬菌体展
示技术的酶联免疫吸附分析检测赭曲霉毒素A(OTA)的方
法, IC50为(0.15±0.02) ng/mL, 线性范围为0.03~0.50 ng/mL,
OTA 的LOD 为0.03 ng/mL, 无交叉反应, 批內加标回收率
为97.0%~115.2%, 批间加标回收率为107.2%~123.1%。
2.5 非法添加的非食用物质检测
ELISA 作为一种经济快速的检测方法在食品中违法
添加的非食物质检测中也有应用。孙凤霞[43]利用获得的单
克隆抗体建立了三聚氰胺的间接竞ELISA 法并制备了试
剂盒, IC50 为(6±0.55) ng/mL, 奶粉LOD 为100 μg/kg, 液态
奶LOD 为20 ng/mL。奶粉样品和液态奶样品的添加回收
率分别为93%~101.9%和83.6%~96.9%, CV<10%, 完全满
足三聚氰胺残留检测的实际要求。裘雪梅等[44]建立了检测
苏丹红Ⅰ的直接竞争ELISA法, 线性范围为0.5~10 ng/mL,
LOD 为0.1 ng/mL, 加标回收率为52.3%~110%, CV 为
3.2%~8.9%。贡东军等[45]建立了间接竞争ELISA 法测定碱
性橙Ⅱ的含量, 采用戊二醛法将牛血清蛋白与碱性橙Ⅱ连
接为完全抗原, LOD 为0.01 ng/mL。
2.6 重金属检测
重金属污染不仅能够改变土壤的组成、功能和结构,
而且还会抑制作物根系生长和光合作用, 影响作物的正常
生长。重金属还能够通过食物链进入人体和动已经成为物
体内, 最终危害人体的健康[46]。重金属难降解和持续污染
是当前重金属残留最为关注的问题, 重金属的检测方法主
要有原子吸收光谱法、原子荧光法、阳极溶出伏安法、催
化极谱法和电感耦合等离子体质谱法等[47], 这些方法不能
满足快速检测的要求, 而酶联免疫吸附方法对于重金属残
留的检测具有重要的研究意义[48]。
王津[49]建立了检测重金属镉的间接竞争ELISA 法,
IC50 为4.18 μg/L, LOD 为0.38 μg/L, 除了与金属汞螯合物
和铬螯合物分别有10.6%和1.8%的交叉反应率外, 与其他
金属螯合物的交叉反应率都小于0.3%。重金属镉的平均回
收率为90.54%~115.36%, CV 为1.35%~9.33%。翟一凡[50]
初步建立了Pb2+和Cr3+的间接竞争ELISA, 与其他重金属
离子的交叉反应率均小于1%, LOD 为0.1 ng/mL, IC50 为5
ng/mL。Darwish 等[51]采用一步竞争ELISA(dc-ELISA)对环
境水样中的Cd2+进行检测, LOD 为0.3 μg/L, 水中常见的
Ca2+、Mg2+、Fe3+在相对高浓度下对检测结果也无干扰。
Cd2+平均回收率为100.29%±3.60%, 批内CV 和批间CV 分
别为3.6%~10.9%和4.81%~10.21%。
2.7 过敏原检测
食品中过敏原已经严重危及人们的生活, 这一食品
安全性指标也是一个需要高度关注的食品营养卫生和食
品安全的问题[52]。目前临床中治疗过敏症的最有效方法
是直接避免食用含有过敏源的食物, 这就要求生产厂家
在食品的标签中直接标明食物中存在的过敏原成分, 避
免消费者因误食而导致过敏。避免食物过敏的首要任务就
万方数据
3976 食品安全质量检测学报 第7 卷
是对食物进行过敏原检测[53]。ELISA 已经广泛应用于临
床化学和食品分析中, 也是检测食品中过敏原的一种快
速有效的方法[54]。
Shibahara 等[55]建立了对鱼过敏原小清蛋白的双抗夹
心ELISA 法, 这种方法使用抗太平洋鲭鱼小清蛋白的多克
隆抗体, LOD 为0.23~0.70 μg/g, 添加回收率为
69.4%~84.8%, RSD<10.5%。Chen 等[56]建立了鱼过敏原的
双抗夹心ELISA 法检测, LOD 为0.1 μg/g, 该方法的批间
CV 和批内CV 分别低于8.9%和9.3%, 该方法无假阳性和
假阴性, 没有交叉反应。张洁琼等[57]建立了检测杏仁过敏
原苦杏仁球蛋白的双抗体夹心ELISA 法, 甜杏仁中苦杏仁
球蛋白的LOD为(6.36±1.02) μg/L; 中国苦杏仁及美国大杏
仁中苦杏仁球蛋白的LOD 分别为(12.11±1.70) μg/L 和
(18.95±1.52) μg/L, 没有交叉反应, 苦杏仁球蛋白的添加回
收率为78.94%~125.15%, RSD<5.81%。
ELISA 方法的准确性和特异性主要依赖于抗体识别
食物过敏原, 但某些食品工业常利用热加工、超高压和酶
解等深加工技术使过敏原蛋白发生变性和降解, 而蛋白质
结构的改变又可干扰蛋白提取物或抗体结合部位, 同时会
导致假阴性结果的出现。此外, 由于某些过敏原缺少特异
性的单克隆抗体, 无法利用ELISA 法进行检测[58]。
2.8 转基因检测
顾 炜 炜 等 [59] 建立了用于检测转基因食品中
Btcry2Ab/2Ac 杀虫蛋白的直接竞争ELISA, LOD 为40
ng/mL, 线性范围40~2000 ng/mL, 回收率在
98.52%~102.27%。王新桐等[60]建立了高灵敏度定量检测转
基因棉花(Gossypium sp.)中新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)双
抗体夹心ELISA 法, 检测范围为3.370~108.125 ng/mL,
LOD 为1.97 ng/mL; 回收率为96.11%~104.69%; CV 为
6.58%~7.33%; 与非转基因棉花内源蛋白质及其他种类转
基因蛋白质均无交叉反应。吕雪飞等[61]建立了定量检测转
基因植物蛋白Cry1Ac 的双抗体夹心ELISA 法, CV<3%,
LOD 为9.49 ng/mL, 对玉米样品提取液中Cry1Ac 蛋白含
量的测定回收率为102.5%~103%。
检测转基因物质的双抗体夹心ELISA 具备多克隆抗
体费用较低、单克隆抗体亲和力高的特点, 使得后续研究
开发的试剂盒检测成本低廉, 灵敏可靠, 而且可以稳定、方
便地提供标准化试剂, 便于实现工业化生产。双抗体夹心
ELISA 检测方法的研究和建立, 为制备免疫胶体金试纸条
提供了便利, 为建立转基因动物的现场、快速查验技术打
下基础, 所以这种检测方法将成为转基因检测领域研究的
主要方向之一[62]。
3 结 论
ELISA 灵敏度高、特异性强、成本低, 设备简单, 不
需要专业的人员操作, 是可以用于实验室的快速检测以及
拥有实验室的其他部门或者企业进行快速检测。但ELISA
也有不足, 如吸附方法需要一些基础的仪器如恒温箱、冰
箱、酶标仪等, 因此不适用于基层的现场快速检测; 基于
酶联免疫吸附方法的原理是抗原抗体的特异性结合, 一些
小分子物质需要与牛血清蛋白等大分子蛋白偶联之后才有
免疫原性, 但并不是所有的小分子物质都能够制出相应的
抗体; 另外, 还需考虑到待测物质结构类似物的干扰会影
响检测的特异性及灵敏度, 不能满足同时检测多种物质的
要求[63]。
随着蛋白质工程和基因工程的发展, 制备单克隆抗
体的技术越来越成熟, 会出现越来越多的ELISA 新技术。
ELISA 技术与气相色谱(gas chromatography,GC)、聚合酶链
式反应(polymerase chain reaction,PCR)等技术的联用, 会
有效地提高ELISA 技术的检测效率[64]。ELISA 法需从以下
几方面进一步完善: (1)研发具有高度免疫性的重组抗原提
高免疫原性; (2)将酶体外的定向进化应用到检测中, 避免
与特异性抗体或抗原的交联; (3)加强标准化, 促进ELISA
相关快检产品商品化的应用。酶联免疫的检测方法从全手
动半自动到全自动发展, 目前还不是很成熟, 需进一步研
究。随着对酶联免疫吸附方法的研究, 灵敏度、精确度、
特异性、重复性会越来越好, 费用会逐步降低, ELISA 在食
品安全检测方面将会得到进一步发展。
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(责任编辑: 姚菲)
作者简介
冯 敏, 硕士, 主要研究方向为食品
质量与安全。
E-mail: 15135101066@163.com
黄登宇, 博士, 副教授, 硕士生导师,
主要研究方向为食品卫生检测。

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