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北京市市售贝类、蔬菜、浆果、即食海产品中诺如病毒污染状况检测及检测方法探析

文档作者：骆海朋1，高飞1，于海瑶2，仝伟健3，任秀1，余文1，崔生辉1 ( ，文档来源： 1．中国食品药品检定研究院 2．吉林省长春市食品药品检验中心 3．甘肃省食品检验研究院		点击数：	更新时间： 2025年06月16日
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中国食品卫生杂志
一2l 8一CHINEsE JOURNAL OF F00D HYGIENE 2017年第29卷第2期
风险监测
北京市市售贝类、蔬菜、浆果、即食海产品中诺如病毒
污染状况检测及检测方法探析
骆海朋1，高飞1，于海瑶2，仝伟健3，任秀1，余文1，崔生辉1
(1．中国食品药品检定研究院，北京100050；2．吉林省长春市食品药品检验中心，吉林长春130012；
3．甘肃省食品检验研究院，甘肃兰州730030)
摘要：目的对北京市市售贝类(牡蛎、贻贝、扇贝、文蛤、毛蚶)、蔬菜(苗菜、生菜)、浆果(草莓、蓝莓)、即食海
产品(三文鱼、即食虾)进行诺如病毒检测。方法贝类、蔬菜、浆果类样品参照IsO／Ts 15216一l方法进行前处理，
虾类检测参照贝类、三文鱼参照蔬菜的方法并进行改良。病毒RNA提取参照罗氏High pure viral RNA Kit试剂盒
方法对样品前处理后的提取液进行提取。实时荧光逆转录聚合酶链反应(实时荧光RT—PCR)的检测使用罗氏
“ghtMix@noroviums GI．GII于“ghtcycler@480 II进行检测，并进行GI—GⅡ分型。诺如病毒阳性样品，参照sN／T
2626—2010《国境口岸诺如病毒检测方法》，使用JVl2、JVl3进行扩增，将获得的DNA扩增片段进行测序并分型。
结果经罗氏试剂盒检测贝类食品478份(40份阳性)、蔬菜62份(1份阳性)、浆果84份(0份阳性)和即食海产
品51份(1份阳性)。有42份为GI．GII，其中37份为GII型，4份为GI型。在42份阳性样品中，有29份GII型阳
性样品对RNA聚合酶区域扩增成功，通过序列分析，27份为GII．17，1份为GII．12，l份为月台伽I眩c口fic抽扫us。结论
通过对北京市市售食品样品中诺如病毒检测发现，贝类食品呈现较明显的季节分布，在冬季检出率较高，贝类食
品是诺如病毒污染率最高的食品。
关键词：诺如病毒；贝类；浆果；即食海产品；实时荧光RT—PcR；食品污染物；检测
中图分类号：R155 文献标识码：A 文章编号：1004—8456(2017)02—0218—05
DOI：10．13590／i．cifh．2017．02．022
SurVey on the contamination ofⅣD阳l，打‘蟊s in sheH矗sh，Vegetable，
fruit and ready-to—eat seafood from markets in Beijing
LUO Hai．pen91，GAO Feil，YU Hai．ya02，TONG Wei-jian3，REN Xiul，YU Wenl，CUI Sheng—huil
(1．National Institute of Food and Drug Control， Beijing 100050， China；2．Jilin Province
Inspection Center fbr Food and Drug，Jilin Changchun 130012， China；3．Gansu ProVince
Food Inspection Institute， Gansu Lanzhou 730030， China)
Abstract：objective To investigate the contamination of JⅣoro秽irⅡ5 in shellfish(oysters，mussels，scallops，clams，
clam)， vegetables (seedling vegetables， 1ettuce)， berries (strawberries， blueberries)， ready—to-eat seafood (salmon，
shrimp)from m丑rkets in Be乎ng． Methods Pretreatment methods fof shenfish，vege￡ables and berr主es samples were
referred to ISO／TS 15216—1；pretreatment method for shrimp and sheUfish was referred to shellnsh method；pretreatment
method for salmon was referred to improved vegetables method． Viral RNA extr8c“Dn was refen．ed to Roche High pure viral
RNA Kit K methods． Real—time reVerse transcription—polymerase chain reaction tes“ng and GI·GII typing were carried out
by Roche LightMixo noroviurus GI·GII in Lightcycler@ 480 II；Ⅳor0"irus positiVe samples was amplified using the prime
of JVl2，JVl3 and the ampli矗ed DNA fhgments were sequenced for subtyping．Resuns 478 shell6sh(40 positjve)，
62 vegetables(1 positive)，84 ber“es(0 positive)and 5 1 raw salmon(1 positive)were detected．35 positive samples
were successfhlly ampli6ed by sequence analysis． 27 samples were GII-17， 1 sample was GII．12，and 1 sample was
点k"nii． cnZici口irus． Conclusion Through the norovims monitoring in Beijing market， shellfish pItsented obvious
seasonal distribution and higher detection ra“j which suggested that the shellfish was the main sources ofⅣoro移irHs in fbod．
Key wOrds：Ⅳor0口抽岱；shellfish；berry；instant seafood；real—time reverse transcription—polymerase chain reaetion；food
contaminant：test
收稿日期：2017．02一15
作者简介：骆海朋男副主任检验技师研究方向为食品微生物学E-mail：haipen91uol23@sina．com
通信作者：崔生辉男研究员研究方向为食品微生物学E—mail：cuishenghui@aliyun．com
万方数据
北京市市售贝类、蔬菜、浆果、即食海产品中诺如病毒污染状况检测及检测方法探析——骆海朋，等
诺如病毒是引起腹泻最常见的食源性病毒之一，
每年感染人数远超沙门菌等常见致病菌。在美国估计
每年由诺如病毒引起的胃肠炎住院人数达56 000～
7l 000人，死亡人数达570～800人⋯。诺如病毒为
直径27 nm、小圆形的病毒，属于杯状病毒科，诺瓦克
病毒属。感染人类的主要为GI和GII型，引起的症
状包括恶心、呕吐、腹泻、腹痛、头痛、发热等，年老体
弱的患者症状可能更严重，也有无症状感染者旧。。。
目前，诺如病毒检测方法主要有分子生物学和
免疫学方法，其中实时荧光逆转录聚合酶链反应
(实时荧光RT—PCR)方法相对较灵敏、特异性高，在
食品检测中应用较广泛’31。国内常用的检测标准
方法不多¨⋯，各个标准对食品样品前处理方法以
及RT．PCR检测方法都有差异。在食品检测中，食
品样品的前处理，病毒RNA的提取非常关键¨⋯。
本文主要参考欧盟ISO／TS 15216．1扣。方法对贝类、
蔬菜、浆果、即食海产品等进行前处理，使用罗氏诺
如病毒相关检测试剂盒进行病毒RNA提取及实时
荧光RT—PCR检测分型。
虽然目前国内由诺如病毒引起的食物中毒报
道很多，但国内有关食品中诺如病毒监测报道较
少，并且主要是针对贝类样品的监测一4⋯。国外对
贝类、蔬菜、草莓中诺如病毒的监测均有报道¨。”。。
为保障我国食品安全监管工作的顺利实施，亟需开
展针对食品中诺如病毒的主动监测，以阐明我国食
品中诺如病毒的污染特征。根据诺如病毒暴发特
点，并结合我国食品安全的实际情况，对北京市市
场上销售的贝类、即食海产品、蔬菜、浆果进行抽样
检测，共计675份，以了解北京市市售食品中诺如病
毒的污染情况。
1材料与方法
1．1 材料
1．1．1 样品采集
2014年9月一2015年2月，采集北京市市场销
售的贝类食品(牡蛎、贻贝、扇贝、文蛤、毛蚶)、即食
海产品(三文鱼、即食虾)、蔬菜(生菜、苗菜)、浆果
(蓝莓、草莓)类食品共675份。详细信息见表1。
表1 诺如病毒检测采样信息
Table 1 Sample information forⅣDro静ir“s detection
注：一表不产地不详。
1．1．2主要仪器与试剂
Lightcycler@480II荧光定量PcR仪(德国罗
氏)、Bio．Bad C1000热循环仪(美国伯乐)、生物安
全柜、高速冷冻离心机、恒温混匀器、电子天平、电
磨匀浆器、碎花制冰机。
蛋白酶K PCR grade、High pure Viral RNA Kit、
Master Hydrolysis Probe、LightMix@ Kit GI—GII均购
自德国罗氏，诺如病毒阳性质控球(中国食品药品
检定研究院提供)，果胶酶(美国S唔ma)，牛肉膏(国
药集团)，磷酸盐(PBs)缓冲液，聚乙二醇(PEG)
8000，Tris，Nacl，研磨杵。
1．2 方法
1．2．1样品前处理
贝类食品样品前处理：取5份贝类样品进行解
剖，取其消化腺和肠道用于检测。如果一份样品的
消化腺和肠道的总质量不够2。0 g，应适当增加取样
量，使得每份样品检验的总质量达到2．0 g。将解剖
下的消化腺和肠道放到50 ml小烧杯内，用电磨均
质器将消化腺仔细打碎呈糊状。将均质的消化腺
分别称取(2．O±0．1)g，加入15 m1离心管中，每管
加入2 ml的PBs缓冲液，加入10斗1 20 mg／m1蛋白
酶K溶液进行消化，活力为30 U。同批次的样品取
1份样品加入诺如病毒阳性质控球，作为外部质控
阳性对照。将上述样品于37℃摇床，
320 r／min振荡l h，恒温水浴60℃，保持15 min。
3 000 x g离心5 min，取200 ng用于RNA提取。
蔬菜样品前处理：将生菜和苗菜剪成2．5 cm×
2．5 cm×2．5 cm大小，称量25 g，放人带有滤膜均
万方数据
中国食品卫生杂志
cHINEsE J0uRNAL 0F FOOD HYGIENE 2017年第29卷第2期
质袋一侧，加入40 ml TGBE buffer(Tris碱12．1 g，
甘氨酸3。8 g，牛肉膏10 g，蒸馏水l 000 ml，
pH=9．5)，其中3份平行加入诺如病毒阳性质控
球，室温摇晃约20 min。将均质袋滤膜一侧液体倾
人50 ml离心管，4℃10 000×g离心30 min，将上
清转移至另一50 m1离心管中，加入l／4体积的5×
PEG／NaCl(PEG8000 500 g，NaCl 87 g，加入450 ml
水加热溶解，然后定容至1 000 m1)溶液，4℃摇晃
60 min。摇晃完毕，4℃10 000×g离心30 min，弃
上清，继续4℃10 000×g离心5 min压实沉淀。向
沉淀加入500恤l PBS缓冲液溶解沉淀。
水果样品前处理：称量草莓和蓝莓25 g，剪成
2．5 cm×2．5 cm×2．5 cm大小，蓝莓体积较小，不
用剪碎。放入带有滤膜均质袋一侧，加入40 ml
TGBE缓冲液。同批次的样品中，取1份样品加入
诺如病毒阳性质控球作为阳性对照。同时加入30 u
的果胶酶(黑曲霉)。室温振荡孵育10 min，使用
pH试纸，测量pH值。若pH<9．0，用NaOH调节至
9．5，再振荡孵育10 min。每调节一次pH值后，孵
育10 min，直至pH>9．0；将流出液倒至离心管中(必
要情况下使用2个离心管)，(5±3)℃10 000×g离
心(30±5)min。上清移至新管或瓶，用Hcl调节
pH=(7．0±0．5)。力Ⅱ入1／4体积的5×PEG／Nacl
缓冲液，在(5±3)℃条件下，于振荡孵育器孵育
(60±5)min。4℃10 000×g离心(30±5)min(必
要情况下将液体分装于2只离心管)。弃去上层溶
液，(5±3)℃10 000×g离心(5±1)min以使颗粒
紧凑。弃去上层溶液，加入(500±lO)肛l PBS缓冲
液重悬沉淀。如果一份样品分两管离心，则用同样
体积PBs缓冲液依次重悬。将重悬液移至新的EP
管中，加入(500士10)斗l氯仿一丁醇溶液，涡旋混匀，
室温孵育5 min。(5±3)℃10 000×g离心
(15±1)min，小心将水相转移至新管待提取RNA。
三文鱼样品前处理：参照ISO／TS 15216-l¨。中
蔬菜的诺如病毒富集的方法，由于三文鱼中存在的
大量蛋白质会对后续的实时荧光RT-PcR产生抑
制，因此加入蛋白酶K去除抑制作用。具体操作过
程如下：取样品25 g，剪碎后放入无菌均质袋中(带
滤网)，加入40 mI TGBE缓冲液。同批次样品中取
1份样品，加入诺如病毒阳性质控球，室温60 r／min
振荡20 min。将样品于冰上静置30 min，4℃
10 000×g离心30 min。吸取上清液，避开脂肪和
离心管底部的沉淀，转入新离心管。加入20出的
蛋白酶K 37℃750 r／min离心I h，再60℃
750 r／min离心15 min。加入1／4体积的5×PEG
溶液，振荡60 s后，于4℃60 r／min振荡60 min；
4℃10 000×g离心30 min，倒掉上清；再于4℃
10 000×g离心5 min；弃上清，加入700 pl PBs缓
冲液重悬。
1．2．2 RNA提取及实时荧光RT—PCR检测
参照Roche High pure viral RNA Kit试剂盒方法
对样品进行提取。在本次检测中使用诺如病毒检测
试剂盒及Lightcycler@480II荧光定量PCR仪用于诺
如病毒的检测。使用诺如病毒阳性质控球作为外部
质控，对病毒RNA的提取过程迸行检测，如外部质控
没有检出，可能在RNA提取过程存在问题。
诺如病毒实时荧光RT—PcR反应体系(20阻1)：
激活剂1．3斗1，引物和探针1斗l，内对照1斗l，促进
剂1斗l，预混液7．4斗l，模板5斗l，水3．3斗l。反应
条件：61℃逆转录3 min，95℃预变性30 s，95℃变
性10 s，56 c|C退火10 s，72℃延伸5 s，共45个循
环，溶解曲线，95℃预变性30 s，40 cc变性2 min，
85℃退火l s，40℃降温30 s。使用PCR仪对诺如
病毒样品进行实时荧光RT—PcR扩增，并进行溶解
曲线的观察。反应完毕使用Lightcycler@
480swl．5．1进行分析，根据说明书对结果进行判
读，判断标准见表2。
表2 Lightcycler@480swl．5．1检测结果的判定标准
Table 2 Determination criteria of the test result
GI
GII
阴性
PcR抑制
污染
有扩增
有扩增
无扩增
无扩增
有扩增
有无扩增均可无信号无扩增
有无扩增均可熔解峰在50—60℃无扩增
有扩增无信号无扩增
无扩增无信号无扩增
有扩增有无信号均可有扩增
1．2．3诺如病毒的分型
诺如病毒的分型参照罗氏检测方法中的结果
判读。同时将诺如病毒阳性样品，使用SN／T
2626—2010《国境口岸诺如病毒检测方法》H1对
RNA聚合酶区域进行扩增，对获得序列进行测序，
根据参考文献[14]于National institute for public
health and environment网站使用软件对测序结果进
行分析，不能够分析的与美国国家生物技术信息中
心(NcBI)的权威序列进行分型比对。
2 结果
2。1 贝类检测
从2014年9月一2015年2月共对478份贝类
样品进行检测，包括28l份牡蛎、49份贻贝、30份毛
蚶、66份扇贝、52份文蛤，具体检测结果详见表3。
万方数据
北京市市售贝类、蔬菜、浆果、即食海产品中诺如病毒污染状况检测及检测方法探析——骆海朋，等一221一
注：一表示未检测。
2．2蔬菜、浆果检测
从2014年12月一2015年2月，共对62份蔬
菜、84份浆果进行诺如病毒的检测，具体检测结果
详见表4。
表4蔬菜、浆果样品的诺如病毒检测结果(％)
Table 4 Vegetable，berries sampleⅣoro口irus test results
注：一表示未检测。
2．3 即食海产品检测
从2015年1～2月，共对27份三文鱼和24份
即食虾进行诺如病毒检测，具体检测结果详见表5。
表5 即食海产品诺如病毒检测结果(％)
Table 5 Ready—to—eat seafoodⅣor0口irus test results
注：一表不未检测。
2．4诺如病毒阳性样品的地域分布
本次诺如病毒的监测贝类阳性样品的区域分
布见表6。在本次监测中，阳性样品种类包括：牡
蛎、贻贝、扇贝、文蛤、生菜、三文鱼。蔬菜和即食海
产品阳性样品的采样地点为北京超市或餐饮企业，
由于商家保密原因，部分样品产地不能够确定。其
中，2家不同的餐饮单位的1份生菜和1份三文鱼
样品检测结果为阳性，但产地不详(见表1)。
表6 贝类阳性样品的地域分布(％)
T8ble 6 Geographical distribution and detection rate of
shellfish positive samples
注：～表示未检测。
2．5诺如病毒阳性样品的分型结果
2．5．1 贝类诺如病毒分型结果
贝类样品中有4份检测为GI型，36份检测为
GII型，其中牡蛎中2份GI型，14份GII型；贻贝中
1份GI型，21份GII型；扇贝中1份GI型；文
蛤1份GII型。
应用SN／T 2626—2010方法对42份罗氏检测
方法为阳性的样品进行扩增，其中罗氏检测方法为
GI型样品没有扩增成功；在罗氏检测方法为GII型
的样品中有28份样品应用sN／T 2626—2010方法
扩增且测序成功。对测得的序列，使用National
institute fbr public health and environment}司立占的软
件，同时与NCBIblast中权威序列进行比对，最终确
认有27份为GII．17，1份为GII．12。
2．5，2蔬菜诺如病毒分型结果
生菜中有1份经罗氏试剂盒方法检出GII型诺
如病毒，经sN／T 2626—20lO方法扩增后测序成功，
于NcBI网站使用Blast软件，与存在的序列进行比
对鉴定为月r0训口抗cnfic撕ru5。
2．5．3 即食海产品诺如病毒分型结果
有1份经罗氏试剂盒方法检出GII型诺如病
毒，而使用sN／T 2626—2010方法进行扩增没有
成功。
3 讨论
2014年9月一2015年2月，共监测675份样
品，样品涉及到贝类、即食海产品、浆果、蔬菜等，共
有42份阳性样品，总检出率为6．2％。虽然已有报
道¨51诺如病毒的成功培养，但对绝大部分实验室诺
如病毒的培养仍然不能实现。目前诺如病毒检测
中比较认可的金标准是荧光定量PcR方法。而在
实际食品检测中，由于诺如病毒的含量较低，在一
些样品中的回收率很低，例如在德国草莓中诺如病
毒的调查，病毒的回收率很低在o％～1％之间¨⋯，
导致诺如病毒检测过程不能保证所有的阳性样品
均能检测出诺如病毒。在最终PcR检测中，对假阴
性的判断有一定的困难，所以需要在检测时合理的
设计检测方法。在本次监测的方法建立时，添加诺
如病毒阳性质控球作为外部质控，判断检测方法是
万方数据
一222一
中国食品卫生杂志
CHINESE JOURNAL OF F00D HYGIENE 2017年第29卷第2期
否为假阴性，添加空白对照控制假阳性，以保证检
测方法可信。
在所有的检测食品中，牡蛎、贻贝、文蛤、扇贝、生
菜及即食海产品中的三文鱼检出诺如病毒，浆果中未
检出。其中，生菜样品虽然经罗氏试剂盒方法检出
GII型诺如病毒，但是经sN／T 2626—2010方法扩增
后测序，于NcBI网站使用Blast软件，与存在的序列
进行比对鉴定为月h伽-抗cozic蒯ru5。贝类食品是诺如
病毒污染的主要类型，检出率达8．4％(40／478)，即
食海产品的检出率为2．0％(1／51)，蔬菜的检出率为
1．6％(1／62)，浆果食品未检出，但是也存在污染的可
能性需要加强重视。
本次监测中诺如病毒的检出以海产品为主，通
过对牡蛎的6个月的检测表明，其与季节的关系非
常紧密，1、2月份的检出率最高，与文献报道Ⅲ1相
符，在贻贝样品中检出率较高。有文献报道¨副在市
场销售的海产品的产地以山东、广东、辽宁为主，此
次监测这些产地均有诺如病毒样品检出，表明在近
海均存在有诺如病毒污染的情况。
2014年12月一2015年3月，北京市感染性腹
泻比前一年多35．6％，达到10 626例，其中29．8％
是由诺如病毒引起，比前一年增加了12．9％。在22
起暴发事件中有20起是由GII．17引起¨⋯。而在
本次监测的食品中检测出的诺如病毒也是以GII．
17为主。提示食品中GII．17诺如病毒的大量检出
与GII．17诺如病毒引起的集中暴发，可能存在一定
的相关性。
贝类食品是造成诺如病毒感染腹泻高风险的
食品，由于近海污水污染的可能性较大，同时牡蛎、
文蛤等贝类食品具有富集诺如病毒的特点，所以建
议在贝类生产区域的选择上，优先选择洁净的海域
进行生产。而非合格区域生产的海产品不能作为
即食海产品食用。加强对餐饮业食品安全监控，防
止交叉污染。
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