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三聚氰胺ELISA试剂盒在食品检测中的检测效果研究

文档作者：谢体波1, 李平1 易重任1, 刘天雷1, 罗贵昆1, 何方洋1,2 文档来源： 1. 贵州勤邦食品安全科学技术有限公司 2. 北京勤邦生物技术有限公司		点击数：	更新时间： 2025年06月30日
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第6 卷 第3 期 食品安全质量检测学报 Vol. 6 No. 3
2015 年3 月 Journal of Food Safety and Quality Mar. , 2015
基金项目: 2013 创新人才计划项目(筑科合同[2013]209-01); 贵州省技术创新项目;
Fund: Supported by 2013 Innovative Talents Scheme([2013]209-01); Guizhou Technology Innovation;
*通讯作者: 李平, 中级工程师, 主要从事食品安全快速检测技术的研究与开发. E-mail: 294173456@qq.com
*Corresponding author: Li Ping, Intermediate Engineer, Guizhou Kwinbon Food Safety Science-Technology Co., Ltd., Guiyang 550009, China.
E-mail: 294173456@qq.com
三聚氰胺 ELISA 试剂盒在食品检测中的
检测效果研究
谢体波1, 李 平1*, 易重任1, 刘天雷1, 罗贵昆1, 何方洋1,2
(1. 贵州勤邦食品安全科学技术有限公司, 贵阳 550009; 2. 北京勤邦生物技术有限公司, 北京 100012)
摘要: 目的为验证本公司生产的三聚氰胺ELISA 检测试剂盒的检测效果。方法 用酶联免疫法对牛奶、
奶粉、鸡肉和鸡蛋等4 种样品中三聚氰胺的残留量进行检测, 并与高效液相色谱法进行对照。结果 结果表明:
该试剂盒对4 种样品的最低检测限分别为19.22、46.86、51.64、21.38 μg/kg, 试剂盒板内板间变异系数均小
于10%; 对4 种样品做加标回收试验, 其回收率均在95%~120%之间, 变异系数均小于10%; 该方法与高效液
相色谱法检测实际样品的阴、阳性判断结果一致。结论 该方法稳定、可靠, 可满足食品中三聚氰胺残留快速
检测的需要。
关键词: 三聚氰胺; 酶联免疫法; 高效液相色谱法; 检测
Research on detection results of melamine enzyme-linked immune
sorbent assay detection kit in food
XIE Ti-Bo1, LI Ping1*, YI Zhong-Ren1, LIU Tian-Lei1, LUO Gui-Kun1, HE Fang-Yang1,2
(1. Guizhou Kwinbon Food Safety Science-Technology Co., Ltd., Guiyang 550009, China; 2. Beijing Kwinbon
Biotechnology Co., Ltd., Beijing 100012, China)
ABSTRACT: Objective To verify the test effect of melamine enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA)
detection kit developed by Beiijng Kwinbon Biotechnology company. Methods The method of ELISA was
used to detect the residues of melamine in milk, milk powder, chicken and eggs, and compared with that of high
performance liquid chromatography (HPLC). Results The results showed that the minimum detection
limitation of the kit for the 4 kinds of samples were 19.22, 46.86, 51.64, 21.38 μg/kg, the coefficient of
variation was less than 10%. The recovery of the method was in the range of 95%~120%, and the coefficient of
variation was less than 10%. The ELISA’s judgments of positive and negative were the same as the HPLC’s.
Conclusion This method was efficient, reliable and sensitive, and could meet the fast-tested for the
determination of melamine residues in food.
KEY WORDS: melamine; enzyme linked immune sorbent assay; high performance liquid chromatography;
detection
第3 期 谢体波, 等: 三聚氰胺ELISA 试剂盒在食品检测中的检测效果研究 1017
1 引 言
三聚氰胺俗称密胺、蛋白精, 是一种三嗪类含氮
杂环有机化合物, 因其分子中含有大量氮元素, 一些
不法商家利用该特点向食品中添加三聚氰胺来提高
蛋白质含量, 但其具有肾毒性[1-3], 长期摄入可导致
肾衰竭、肾结石等[4], 并可诱发膀胱癌。目前, 针对
乳制品及其他食品中三聚氰胺残留量的检测方法主
要有高效液相色谱法(HPLC)[5,6]、液相色谱-质谱/质谱
法(LC-MS/MS) [7]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS) [8]
等, 但这些方法通常需要昂贵的仪器和高素质的检验
人员, 而且检测成本较高, 会浪费大量人力、物力[9];
这些因素限制了大型仪器检测方法的大面积推广和
批量检测, 不便于终端消费者进行快速筛选和诊断。
快速检测方法主要有酶联免疫法, 胶体金免疫层析
法等, 其中酶联免疫法是一种灵敏度高、特异性强、
重复性好的检测方法[10], 具有操作方便、成本较低等
优点, 被广泛应用于食品中残留三聚氰胺检测。市场
上针对三聚氰胺快速检测的进口试剂盒主要有美国
Rome Labs、Abraxis、Beacon 及Strategic Diagnostics
公司的产品[11], Beacon 公司生产的试剂盒的检测结
果略高于HPLC方法的检测结果[12], Rome Labs 公司
的试剂盒检出限为9 ng/mL; 国内也有许多用于食
品中三聚氰胺或三聚氰酸残留检测的试剂盒, 例如,
北京维德维康生物技术有限公司及农科院质量标准
与检测技术研究所开发的试剂盒, 但这些试剂盒在
三聚氰胺类似检测及相关性能评估方面的数据较
少[13]。
为验证本公司生产的三聚氰胺酶联免疫检测试
剂盒的检测效果, 本研究采用酶联免疫检测方法对
牛奶等4 种样品中三聚氰胺残留量进行检测, 并与高
效液相色谱法检测结果进行对照, 以期为我国食品
安全快速检测方面提供一些简单、快速、准确的检测
方法。结果表明, 我公司生产的试剂盒回收率在
95%~120%, 损失较少, 检测牛奶样品的灵敏度为
0.5 mg/kg, 比国内一些试剂盒的灵敏度高(10-6)[13]。
2 材料与方法
2.1 材 料
2.1.1 样品与试剂
牛奶、奶粉、鸡肉、鸡蛋均为市售; 三聚氰胺
(Melamine)ELISA 检测试剂盒(北京勤邦生物技术有
限公司); 乙腈、浓盐酸、甲醇、丙酮(分析纯, 天津
市富宇精细化工有限公司)。
2.1.2 仪器与设备
微孔板酶标仪(KHB ST-360, 上海科华实验系统
有限公司), 振荡器(SHA-C, 金坛市白塔金昌实验仪
器厂), 涡旋仪(QL-901, 海门市其林贝尔仪器制造有
限公司), 离心机(DT5-2, 北京时代北利离心机有限
公司), 匀浆机(MJ-BL2504, 美的), 天平(ESJ200-4,
沈阳龙腾电子有限公司), 微量移液器(Thermo)。
2.2 方法
2.2.1 样品前处理方法
(1) 牛奶样品前处理方法
移取400 μL 牛奶样本至2 mL 聚苯乙烯离心管
中, 加入800 μL 乙腈, 用涡旋仪涡动1 min, 3000 g
以上, 室温(20~25 ℃)离心5 min; 移取100 μL 上清
液至2 mL 聚苯乙烯离心管中, 加入500 μL 复溶工作
液, 用涡旋仪涡动1 min, 混匀; 取50 μL 用于分析。
(2) 奶粉样品前处理方法
称取(1.0±0.05) g 奶粉样本至10 mL 聚苯乙烯离
心管中, 加入2.5 mL 去离子水, 用振荡器振荡3 min
至奶粉完全溶解; 移取400 μL 样本液至2 mL 聚苯乙
烯离心管中, 分别加入400 μL 乙腈、400 μL 甲醇, 用
涡旋仪涡动1 min, 3000 g 以上, 室温(20~25 ℃)离心
5 min; 移取100 μL 上清液至2 mL 聚苯乙烯离心管
中, 加入500 μL 复溶工作液, 用涡旋仪涡动1 min,
混匀; 取50 μL 用于分析。
(3) 鸡肉样品前处理方法
称取(1.0±0.02) g 组织样本至50 mL 聚苯乙烯离
心管中; 分别加入2 mL 丙酮、2 mL 去离子水, 用振
荡器振荡5 min, 3000 g 以上, 室温(20~25 ℃)离心5
min; 移取100 mL 上清液至2 mL 聚苯乙烯离心管中,
加入900 mL 复溶工作液, 用涡旋仪涡动1 min, 混匀;
取50 mL 用于分析。
(4) 鸡蛋样品前处理方法
称取(1.0±0.05) g 鸡蛋样本至50 mL 聚苯乙烯离
心管中, 分别加入4.5 mL 去离子水、0.5 mL 甲醇, 用
振荡器振荡5 min, 3000 g 以上, 室温(20~25 ℃)离心
10 min; 移取100 μL 上清液至2 mL 聚苯乙烯离心管
中, 再加入300 μL 复溶工作液用涡旋仪涡动1 min,
混匀; 取50 mL 用于分析。
1018 食品安全质量检测学报 第6 卷
2.2.2 样品检测方法
所有试剂与酶标板放在实验桌上回温至室温
(20~25) ℃, 试剂摇匀; 将样品和标准品编号, 每样
做2 个平行; 取50 μL 样品(标准品)加入到对应微孔
中, 再加入酶标二抗和抗体工作液50 μL, 震荡摇匀,
用盖板膜盖板后于25 ℃避光反应30 min; 揭开盖板
膜, 将孔内液体甩干, 加入洗涤工作液250 μL, 充分
洗涤4~5 次, 每次间隔10 s, 倒掉洗涤液, 用吸水纸
拍干; 每孔加入50 μL 底物液A 液和B 液, 震荡摇匀
后用盖板膜盖板置于25 ℃避光反应15 min; 反应后
加入终止液50 μL, 震荡摇匀, 设定酶标仪于450 nm
处, 测定每孔OD 值。
2.2.3 三聚氰胺浓度的计算
百分吸光率的计算, 标准品或样品百分吸光率
等于标准品或样品的吸光度值的平均值除以第一
个标准品(0 ppb) 的吸光度值的平均值, 再乘以
100%, 即
百分吸光率(%)=B/B0×100%
B—标准品或样品溶液的平均吸光度值
B0—0ppb 标准溶液的平均吸光度值
将样品的百分吸光率代入标准曲线中, 从标准
曲线上读出样品所对应浓度, 乘以其对应稀释倍数
即为样品中三聚氰胺实际浓度。
2.2.4 试剂盒相关指标检测方法
分别对试剂盒的检测限、精密度、准确度进行试
验, 并将灵敏度、精密度和准确度与HPLC 检测的灵
敏度、精密度和准确度进行对比。
(1)试剂盒检测限测定方法
分别对20 份空白牛奶、奶粉、鸡肉、鸡蛋样品
进行检测, 计算三聚氰胺浓度, 以20 份样品中三聚
氰胺浓度的平均值( X )和标准差(S)来表示检测限
(LOD), 即LOD=( X )+3S, 为试剂盒检测限。
(2)试剂盒精密度测定方法
取10 个试剂盒, 每盒随机取1 块酶标板, 每块
酶标板中随机抽取20 个微孔, 测定9 μg/L 标准溶液
的吸光度值(OD), 计算变异系数。
(3)样品准确度和精密度测定方法
向空白样品中加入三聚氰胺标准品, 使牛奶中
三聚氰胺终浓度为0.5、1.0、2.0 mg/kg, 奶粉、鸡肉
和鸡蛋中三聚氰胺终浓度为1.0、2.5、5.0 mg/kg; 每
种样品、每个浓度均5 个平行, 按2.2.2 操作方法测
定, 分别计算板内、板间变异系数及回收率。
2.2.5 仪器测定方法
参照国标GB/T 22288-2008、GB 29704-2013 和
GB/T 22388-2008[14-16]。
3 结果与分析
3.1 标准曲线的绘制
分别测定0、1、3、9、27、81 ppb 标准品的吸
光度值, 以三聚氰胺标准品浓度的对数为横坐标, 三
聚氰胺标准品的百分吸光率为纵坐标, 绘制标准曲
线。以三聚氰胺标准品浓度的对数为横坐标,
ln[B/(B0-B)]为纵坐标建立双对数直线拟合曲线, 数
学模型为ln[B/(B0-B)]=a+blogC。从图1 和图2 中可
知, 标准曲线方程为: Y= -2.134X+1.243, R2=0.996;
说明三聚氰胺的ELISA 检测试剂盒线性关系良好。
图1 标准曲线
Fig. 1 The standard curve
图2 标准曲线方程
Fig. 2 Standard curve equation
3.2 试剂盒检测限测定结果
按照2.2.4 方法, 得到三聚氰胺ELISA 检测试剂
盒对牛奶、奶粉、鸡肉、鸡蛋样品的检测限如表1, 从
第3 期 谢体波, 等: 三聚氰胺ELISA 试剂盒在食品检测中的检测效果研究 1019
表中结果可知, 该试剂盒对牛奶、奶粉、鸡肉、鸡蛋
几种样品的最低检测限分别为19.22、46.86、21.38、
51.64 μg/kg, 远低于国际食品法典委员会对婴儿配
方奶粉 (≤1 mg/kg)和其他食品中(≤2.5 mg/kg)的限
量要求, 说明该试剂盒灵敏度较高。
3.3 试剂盒精密度测定结果
酶标板精密度测定结果如表2, 从表中可知, 三
聚氰胺ELISA 检测酶标板的板内变异系数在1%~5%
范围内, 板内板间变异系数均小于10%, 说明该试剂
盒重现性较好, 性能较为稳定。
3.4 样品准确度和精密度的测定结果
向牛奶、奶粉、鸡肉、鸡蛋四种空白样品中分别
添加不同浓度的三聚氰胺, 每个浓度各5 个平行, 同
时做空白对照, 按2.2.4 操作方法测定。分别计算标
准偏差及回收率, 从表3 中可知, 四种样品回收率均
在95%~120%之间, 变异系数均小于10%, 符合《农
业部文件》农医发[2005]17 号附件2 中试剂盒备案参
考证券标准中第4 点关于精密度和准确度的规定, 说
明该三聚氰胺ELISA 检测试剂盒精密度良好。
3.5 ELISA 试剂盒与高效液相色谱(HPLC)法
检测结果比较
3.5.1 灵敏度比较
随机抽取市售牛奶、奶粉、鸡肉和鸡蛋样品各5
份, 分别用ELISA 试剂盒和高效液相色谱测定样品
中三聚氰胺残留量, 由表4 可知, ELISA 试剂盒检测
结果与仪器检测结果复核率为100%, 说明ELISA 检
测试剂盒灵敏度较高; 检测20 个样品中三聚氰胺残
留量均未超标, 合格率达到100%, 说明相关部门已
经加大对食品安全监管力度, 违法现象大大减少, 保
障人民食品安全和健康。
3.5.2 准确度和精密度比较
在同等条件下, 对空白牛奶样品做三聚氰胺添
加量为0.5 mg/kg 的添加回收试验(其中, ELISA 试剂
盒检测方法中, 随机选取3 块酶标板, 每块板做4 个
平行), 比较ELISA 试剂盒和高效液相色谱法回收率
和变异系数, 由表5 可知, 仪器检测方法的回收率在
表1 检测限测定结果
Table 1 Result of detection limit
样品
(samples)
三聚氰胺浓度
均值( X )
标准差
(S)
最低检测限
LOD(μg/kg(L))
牛奶 18.66 0.19 19.22
奶粉 45.78 0.36 46.86
鸡肉 20.38 0.34 21.38
鸡蛋 50.63 0.34 51.64
表2 精密度结果
Table 2 Results of accuracy
酶标
板号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
CV% 2.42 3.86 1.34 3.38 3.10 1.25 1.79 1.57 1.08 1.57
表3 样品准确度与精密度测定结果
Table 3 Results of precision and accuracy on samples
分类 加标量, mg/kg(L) 测定均值, mg/kg(L) 标准差 回收率/% CV/%
牛奶
0.5 0.50 0.01 99.12 1.63
1.0 1.07 0.05 106.70 4.44
2.0 2.04 0.05 101.92 2.67
奶粉
1.0 1.03 0.07 102.66 6.97
2.5 2.47 0.13 98.64 5.11
5.0 5.15 0.10 103.00 1.96
鸡蛋
1.0 1.07 0.07 107.40 6.13
2.5 2.50 0.08 100.08 3.08
5.0 5.08 0.09 101.52 1.87
鸡肉
1.0 0.98 0.02 98.00 2.28
2.5 2.53 0.11 101.12 4.39
5.0 5.36 0.22 107.28 4.08
1020 食品安全质量检测学报 第6 卷
表4 ELISA 试剂盒与仪器方法灵敏度比较(mg/kg(L))
Table 4 Comparison of sensitivity between ELISA kit and HPLC (mg/kg(L))
样品 方法 1 2 3 4 5
牛奶
ELISA 0.25 0.56 0.73 0.82 0.13
HPLC 0.16 0.52 0.63 0.85 0.11
奶粉
ELISA 1.01 0.97 0.53 1.21 0.87
HPLC 0.98 1.03 0.57 1.17 0.91
鸡蛋
ELISA 1.38 1.56 2.13 1.02 0.83
HPLC 1.35 1.48 2.07 0.89 0.91
鸡肉
ELISA 1.01 1.32 1.79 1.06 0.13
HPLC 1.21 1.16 1.65 0.97 0.19
表5 ELISA 试剂盒与仪器方法精密度和准确度比较
Table 5 Comparison of precision and accuracy between ELISA kit and HPLC
分类 三聚氰胺的回收率/% 平均回收率/% 变异系数CV/%
ELISA
99.70 103.33 97.78 98.99
98.56 99.34 101.56 109.23 102.19 3.74
104.78 103.22 109.98 99.78
HPLC 96.78 105.38 98.23 96.89 99.32 4.12
96.78%~105.38%, 平均回收率为99.32%, 变异系数
为4.12%; 同样添加浓度, ELISA 试剂盒的回收率在
97.78%~109.98%之间, 平均回收率为102.19%, 试剂
盒板间变异系数为3.74%; ELISA 法和HPLC 法测定
结果基本一致, 符合度基本达到100％, 适用于牛奶
样品中三聚氰胺残留检测。
4 结 论
本研究采用酶联免疫法对牛奶、奶粉、鸡肉和鸡
蛋4 种样品中三聚氰胺残留量进行检测, 验证本公司
生产的三聚氰胺ELISA 检测试剂盒检测效果, 并将
其检测效果与仪器检测方法做对照。结果表明, 三聚
氰胺ELISA 检测试剂盒检测灵敏度较高, 对牛奶、
奶粉、鸡肉、鸡蛋样品最低检测限较低, 远低于国家
规定最高残留量; 与高效液相色谱检测法相比, 检测
结果一致, 且试剂盒检测用时短(30 min), 样品前处
理方法简单, 操作方便, 检测设备投入少, 耗能低,
可满足对奶粉等样品中残留三聚氰胺的快速检测。
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(责任编辑: 李振飞)
作者简介
谢体波, 中级工程师, 主要从事食品
安全快速检测技术的研究与开发。
E-mail: 394736614@qq.com
李平, 中级工程师, 主要从事食品安
全快速检测技术的研究与开发。
E-mail: 294173456@qq.com

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