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实时荧光定量PCR技术在食用油脂检测中的应用

文档作者：刘鹏飞1 马静1 江晓颖2 刘静雯1 3 苏国成1 4 李健1 3, 4* ( , 厦文档来源： 1. 集美大学食品与生物工程学院 2. 厦门中集信检测技术有限公司 3. 厦门市海洋功能食品重点实验室 4. 厦门市食品科技研发检测中心		点击数：	更新时间： 2025年07月02日
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第8 卷 第2 期 食品安全质量检测学报 Vol. 8 No. 2
2017 年2 月 Journal of Food Safety and Quality Feb. , 2017
基金项目: 教育部留学回国人员科研启动基金、福建省教育厅科研项目 (JA15276)、厦门南方海洋研究中心项目 (13PZP002SF24、
14CZP047HJ21)、集美大学科研基金资助
Fund: Supported by the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, State Education Ministry, Foundation of
Education Department of Fujian Province (JA15276), Xiamen Southern Oceanographic Center (13PZP002SF24, 14CZP047HJ21) and the
Scientific Research Foundation of Jimei University
*通讯作者: 李健, 副教授, 主要研究方向为食品安全、食品生物技术、天然化合物, E-mail: lijian2013@jmu.edu.cn
*Corresponding author: LI Jian, College of Food and Bioengineering, Jimei University, Xiamen Key Laboratory of Marine Functional Food,
Xiamen Food Research and Inspection Center, Xiamen 361021, China. E-mail: lijian2013@jmu.edu.cn
实时荧光定量 PCR 技术在食用油脂检测中的应用
刘鹏飞1, 马 静1, 江晓颖2, 刘静雯1, 3, 苏国成1, 4, 李 健1, 3, 4*
(1. 集美大学食品与生物工程学院, 厦门 361021; 2. 厦门中集信检测技术有限公司, 厦门 361021;
3. 厦门市海洋功能食品重点实验室, 厦门 361021; 4. 厦门市食品科技研发检测中心, 厦门 361021)
摘要: 荧光定量PCR 检测技术具有快速、准确的优点, 在转基因食品检测等领域得到了广泛的应用。采用
荧光定量PCR 技术进行油脂转基因、掺假检测也成为研究热点。利用不同油料作物所含有的独特核酸序列, 采
用荧光定量PCR 技术可简单、高效、快速地检测出油脂中所含的特定核酸成分, 从而判定油脂原料的构成, 为
打击食用油脂掺假造假提供判定依据。植物油的加工过程中都经过多个步骤的处理, 其中的核酸降解严重, 含
量极低, 所以从植物油中提取出较高质量的DNA 是对油脂进行荧光定量PCR 检测鉴定的关键。本文主要对
油脂DNA 提取方法及存在的难点、引物设计特点和结果分析进行了论述, 以期为今后荧光定量PCR 检测技
术进一步推广与应用提供思路。
关键词: 实时荧光定量PCR; 食用油脂; DNA 提取
Application of real-time fluorescent quantitative PCR technology in the
detection of edible oils
LIU Peng-Fei1, MA Jing1, JIANG Xiao-Ying2, LIU Jing-Wen1,3, SU Guo-Cheng1,4, LI Jian1, 3,4*
(1. College of Food and Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Xiamen Zhongjixin Testing Co.,
Ltd., Xiamen 361021, China; 3. Xiamen Key Laboratory of Marine Functional Food, Xiamen 361021, China;
4. Xiamen Food Research and Inspection Center, Xiamen 361021, China)
ABSTRACT: Fluorescence quantitative PCR technology has been widely used in the detection of genetically
modified food and other fields for its quickness and accuracy, and it also becomes popular in transgenic detection and
adulteration detection of edible oil. By taking advantage of the unique nucleic acid sequence of different species, the
specific nucleic acid composition contained in different oil crops can be detected, and the raw material constituent of
edible oil can be predicated, so as to provide the evidence for administrative organization to punish the adulterations
of edible oil. The quantity and integrity of DNA of edible oil is very low due to the multiple refined processes. It is
critical to get high quality DNA from edible oils for real-time fluorescent quantitative PCR analysis. This article
mainly reviewed methods and existing problems of DNA extraction, primer design characteristics and result analysis,
so as to provide perspectives for further application of real-time fluorescent quantitative PCR in future.
KEY WORDS: real-time fluorescent quantitative PCR; edible oils; DNA extraction
万方数据
526 食品安全质量检测学报 第8 卷
1 引 言
食用油是居民饮食中不可缺少的一部分, 为有效监
控食用油脂安全, 监管部门和研究者提出了多种检测方法
[1,2]。通常主要的油脂检测指标有酸价[3]、胆固醇[4]、过氧
化值[5]、挥发性成分[6]等, 主要检测技术有近红外光谱[7]、
电导率与极性物质测定[8]、气相色谱[9]和质谱法[10]等。随
着各种检测方法的优化, 一些新型的检测技术也逐渐出现,
诸如电子鼻[11]、快速检测试纸[12]、核磁共振[13]等。具体的
方法应用有: 利用分光光度法特征波长检测花生油中的棉
籽油[14], 红外光谱法鉴定橄榄油[6], 气相色谱法构建特征
模型检测大豆油中的棕榈成分[15]等。上述方法有其使用的
优点, 但也有其局限性, 如无法检测油脂的转基因成分,
无法鉴别使用油脂的掺假使假, 不能分辨出地沟油中的微
生物污染, 电子设备检测所需的成本较高在实际应用时不
具普遍性等。
核酸作为每个物种的～身份证～, 具有性质稳定、特异
性好、PCR 扩增后产生特征片段明显等特点, 尤其在临床
检测方面的应用广泛。在转基因食品成为热门话题的今天,
转基因成分的潜在危险性不明, 有些产品没有明确标识转
基因成分而对消费者产生误导等负面影响。由于食用油脂
生产原料包括转基因大豆、油菜籽等, 使得荧光定量PCR
技术成为食用油脂的转基因成分检测首选技术, 实现油脂
分子水平检测成为发展趋势[16]。该技术操作简便, 通过设
备的自动分析可同时检测几十个样品, 整个检测过程耗时
短。本文主要从食用油脂中DNA 的提取、引物设计、荧
光定量PCR 在油脂检测中的具体应用和结果分析等方面
介绍实时荧光定量PCR 技术及其在食用油脂安全检测中
的应用。
2 食用油脂中DNA 的提取
食用油脂包括可食用动物油脂和植物油脂, 植物油
脂根据提取工艺不同又分为压榨型和浸提型, 制取时精炼
程度的不同使得压榨型较浸提型油脂中核酸含量高。但无
论是动物油还是植物油在生产过程中均要经历高温、脱色
和脱臭等处理, 核酸片段在各个阶段发生不同程度的降解,
破碎后的DNA 片段小于200 bp, 因此实现DNA 分子的富
集是实现荧光定量PCR 技术在油脂检测中应用的前提。
在提取过程中如何富集和脱脂是能否成功提取到核
酸的关键。核酸易溶于水或缓冲液, 油样中核酸提取液多
采用无菌水、十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethyl
ammonium bromide, CTAB)缓冲液和三羟甲基氨基甲烷-乙
二胺四乙酸(Tris-EDTA, TE)缓冲液。振荡提取时, 由于振
速过高易产生乳化层, 因此需要利用有机溶剂消除乳化,
有机试剂可选用正己烷、乙醚和丙酮等; 而对于蛋白含量
较高的原料, 为了减少蛋白质对核酸测定及PCR 过程的干
扰, 将会进一步用氯仿-酚纯化DNA。一般要求用于PCR
扩增的模板DNA 纯度OD260/OD280 值在1.8～2.0, 若低于
1.8 说明存在蛋白或苯酚的残留, 模板纯度不高。对油脂
DNA 提取而言, 彻底除去苯酚是纯化DNA 的关键步骤。
在DNA 粗提阶段, 通常采用提取液体积与油样体积
比例为1:10。食用原油中DNA 残留量较为理想, 而对于精
炼程度很高的商品油可能需要增加油样比例富集DNA。水
油混合振荡利于DNA 分子萃取, 而此过程易形成乳化层,
造成水油分相困难, 在后续的研究中还应确定合适的振摇
条件, 某些颜色较深的原油还会有色素沉淀, 需要根据不
同油样种类作相应调整, 同时配合有机试剂处理。
一般油样提取步骤如下: ①1 mL 提取液加入1 g 猪油
溶化猪油, 室温振荡10 min; ②12000 r/min 离心10 min, 弃
去上层油脂, 再加入溶化猪油, 重复10 次左右, 提取液与
猪油比例约1:10; ③利用CATB 法[17]进行后续处理, 氯仿-
异戊醇-酚除去有机溶剂, 异丙醇或乙醇沉淀DNA; ④复溶
DNA。同时可以配合离心柱, 使获得的DNA 纯度更高。
3 引物设计[18,19]
设计引物是实现荧光PCR 技术应用的另一个难点。
油脂中残留的核酸特点是含量低、片段小和特异性不明。
设计时应根据各物种的特征, 寻找保守区间且基因片段较
短。通过对本文引用的引物对做了统计归纳, 植物基因扩
增产物片段分布表见图1, 常用油料作物的引物见表1, 其
中涵盖了大豆、花生、油菜籽、棕榈、芝麻、棉花、玉米、
橄榄和葵花籽等常用油料作物。常用植物内参基因如表2
所示。为了检测转基因原料使用情况, 还设计了专门针对
油料作物的引物以及其内参基因(表3)。为了检测食用油脂
中可能添加的动物源性油脂, 设计了专门针对动物油脂检
测的引物及内参基因(表4)。
图1 植物基因扩增产物片段分布
Fig. 1 Fragment distribution of amplified plant genes
万方数据
第2 期 刘鹏飞, 等: 实时荧光定量PCR 技术在食用油脂检测中的应用 527
表1 常用油料作物的引物
Table 1 Primers for regular oil-bearing crops
NCBI 序列号 上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') 扩增产物
(bp)
来源
大豆
XM_003518752.2 GCCCTCTACTCCACCCCCATCC GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG 118 [20]
XM_003518752.2 GCCCATCTGCAAGCCTTTTT GCCGAAGCAACCAAACATG 294 [21]
XM_003518752.2 GATGGATCTGATAGAATTGAC CTCTACTCCACCCCCATC 233 [21]
XM_003518752.2 TCGCCGCTTCCTTCAACTT GCCCATCTGCAAGCCTTTTT 77 [21]
花生
HQ439774.1 GGTGCCAACACAAACTCCAAC GTTACTCCCATAGCCAATCTTCAA 81 [20]
FJ713110.1 GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG CGCTGTGGTGCCCTAAGG 72 [22]
TCAGAATCCCATCCGGTTTC GTGTTAACGCGCATGGAGAT 91 [23]
油菜籽
D13987.1 CCAGTTCTTGGAGCCGCTTGA AAGGGCCAGTCCAAATGCAGA 121 [20]
AF127919.1 GGTCGTCCTCCTAAGGCGAAAG CTTCTTCGGCGGTCGTCCAC 99 [24]
X77576.1 GGTGAGCTGTATAATCGAGCGA GGCGCAGCATCGGCT 104 GB/T
19495.5-2004[25]
棕榈 AJ236914.1 AGGGCAATTCCTAATGTATTGGAC CGCAGTTAGAGCCGCATTT 109 [20]
芝麻
AF240005.1 CCAGAGGGCTAGGGACCTTC CTCGGAATTGGCATTGCTG 62 SN/T1961.12-201
3[26]
AF240005.1 TTACCAGAGGGCTAGGGACCTT AACTCGGAATTGGCATTGCT 66 [21]
棉花 CGTGGCCTCGCGATCTGA
CTTCCATGCCGCCTCACAAG
CTCAGCGGCGGAGCTACAG
ACCCAGCCCTCCAAAGATT 89 SN/T3577-2013[27]
玉米
JQ083080.1 TGAACCCATGCATGCAGT GGCAAGACCATTGGTGA 190 SN/T
1203-2010[17]
BT065903.1 CGGTGGATGCTAAGGCTGATG AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC 88 [21]
AJ131373.1 TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT 79 GB/T19495.5-2004
BT065903.1 CTCCCAATCCTTTGACATCTGC TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG 151 GB/T19495.5-2004
橄榄
JF738736.1 AATCTTCTACTGGTACATGGAC AGTAACAGAACCCTCTTCAAAT 164
ACTCGCACACACTCCCTTTCC TTTTTAGCTCACTGGCCATCC 115 [28]
AJ001766 GGTGTTATTCCCGTGGCTTCAG ACGGAATCATCCCCAAAGATCTC 80 [29]
AJ001766 AAAGGGCGATGCTACCATATTGA GGGATTCGCAGATCTTCCAGAC 182 [29]
AJ416321 GTTCGCCAAAAGGACCGACAT GCCAGACATGGTGCAGCAGTT 82 [29]
AJ416321 TACACCACGGTCATGCAAGTCC TGGCGAACAGAAGACCGATAATG 193 [29]
葵花籽 CTCGAGCACCTCCGGCT GGATTGGATGGCATTCGG 60 [21]
表2 植物内参基因引物
Table 2 Primers for plant housekeeping genes
NCBI 序号 上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') 扩增长度(bp) 来源
HM850302.1 AATGAAGGACGTGATCTTGC AGTTCAGGACTCCATTTGC 71 [30]
AB861614.1 TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 137 [31]
KF600709.1 CGAAATCGGTAGACGCTACG TTCCTAAGAGTCTCTGCACCT 199 SN/T1204-2003[32]
万方数据
528 食品安全质量检测学报 第8 卷
表3 植物中转基因成分引物
Table 3 Primers for transgenic ingredients
上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') 扩增产物(bp) 来源
大豆
CCGACGCCGATCACCTA GATGCCGGGCGTGTTGAG 87 SN/T 1204-2003
CATTTGGAGAGGACACGCTGA GAGCCATGTTGTTAATTTGTGCC 74 GB/T19495.5-2004
CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGG GACTTGTCGCCGGGAATG 121 GB/T19495.5-2004
TAGCATCTACATATAGCTTC GACCAGGCCATTCGCCTCA 85 GB/T19495.5-2004
TCATCCCTTACGTCAGTGAG CCATCATTGCGATAAAGGAAA 165 专利201010596930.X[33]
油菜籽 GTCTTCGTGTTGCTGGAACCGTT GAACTGGCAGGAGCGAGAGCT 121 GB/T 19495.5-2004
棉花
CGTGGCCTCGCGATCTGACT
AAGATGCCTCTGCCGACAGT
CTCAGCGGCGGAGCTACAGA
GCGAAGGATAGTGGGATTGT 196 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACT
TGAATCCTGTTGCCGGTCTT
CTCAGCGGCGGAGCTACAGACG
TATTAAATGTATAATTGCGGGA 184 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACT
GAGTCCGTGGATGCTTTGTTC
CTCAGCGGCGGAGCTACAGA
ATCATGGCGATGTTGGTGTC 111 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACTCC
AATACAGTTCCAGCTACAGCTA
CTCAGCGGCGGAGCTACAGA
CACCCACGATGTTACCGAGT 151 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACTT
TGAAATTAAAAACCAATGCCAC
CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGA
TGTTAGTTTCCCATTCGAGTTT 133 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACTGG
CTAACATAAGTAGCTGTGAGTGA
CTCAGCGCCGGAGCTACAGA
AGATTGTCGTTTCCCGCCT 194 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACTT
GTCATCTATGTTACTAGATCGGGG
CTCAGCGGCGGAGCTACAGAG
CCGAACGCTGTTATCCTCAT 206 SN/T3577-2013
玉米
CGCGACTGGATCAGGTACA TGGGGAACAGGCTCACGAT 76 SN/T 1204-2003
TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT 92 GB/T19495.5-2004
GATGCCTTCTCCCTAGTGTTGA GGATGCACTCGTTGATGTTTG 113 GB/T19495.5-2004
CCCATCGACATCAGCCTGAGC CAGGAAGGCGTCCCACTGGC 129 GB/T19495.5-2004
TGTTCACCAGCAGCAACCAG ACTCCACTTTGTGCAGAACAGATCT 100 GB/T19495.5-2004
AAAAGACCACAACAAGCCGC CAATGCGTTCTCCACCAAGTACT 127 GB/T19495.5-2004
GAAGCCTCGGCAACGTCA ATCCGGTTGGAAAGCGACTT 133 GB/T19495.5-2004
GCCAGTTAGGCCAGTTACCCA TGAGCGAAACCCTATAAGAACCCT 149 GB/T19495.5-2004
AGGATCTCGTCGTGACCCAT GCACGAGGAAGCGGTCA 183 SN/T1204-2003
ACAAGCACGGTCAACTTCC ACTCGGCCGTCCAGTCGTA 175 SN/T1203-2010
内参基因 GTCTACATGTCTCCGGAGAG GCAACCAACCAAGGGTATG 191 SN/T1203-2010
引物 ATCGTTCAAACATTTGGCA ATTGCGGGACTCTAATCATA 165 SN/T1203-2010
CGACAGTGGTCCCAAAGA AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC 74 SN/T1203-2010
万方数据
第2 期 刘鹏飞, 等: 实时荧光定量PCR 技术在食用油脂检测中的应用 529
表4 动物源性引物
Table 4 Primers for animal ingredients
名称 上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') 扩增产物
(bp)
来源
牛β2m CTGCTATGTGTATGGGTTCC GTAGAAAGACCAGTCCTTGC 115 SN/T3496-2013[34]
猪β2m GAAGGTTCAGGTTTACTCACG TCAGCAAATCAATTTCAATCTGG 107 SN/T3496-2013
羊线粒体 TTTCGCCTTTCACTTTATTTTCCC GGGTTGTTGGATCCTGTTTCG 90 SN/T3496-2013
MGH 牛生长激素基因 CCTCAGACGGGTCTTCACCA CGTGTCAGGATTGGGTAAT SN/T2557-2010[35]
BGH 牛生长激素基因 CCGATGGATGTGTTCAGAGCT GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC SN/T2557-2010
牛源性 CAACAGGAATCTCCTCAGACGTAGA GCTAGAATTAGTAAGAGGGCCCCTAA 91 [36]
HOXC5 基因 CGTAGCCAATTCATTCTATA TGGGAAAGTGATGCTTAA 138 [37]
SV40polyA 猿猴空泡病毒 TCACAAATTTCACAAATAAAGC ACATGATAAGATACATTGATGAG 82 SN/T3496-2013
NPTⅡ新霉素-3,-
磷酸转移酶基因
TATGACTGGGCACAACAGAC CGTCTTGCAGTTCATTCAGG 124 SN/T3496-2013
CMV 启动子 GTTCCGCGTTACATAACTTACGG AAGTCCCTATTGGCGTTACTATGG 113 SN/T3496-2013
GFP 绿色荧光蛋白 AACCGCATCGAGCTGAAG GTTGTGGCGGATCTTGAAG 150 SN/T3496-2013
内参基因引物
AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA 234～262 [38]
AGGGATAACAGCGCAAT GTTCTTGAACTCAGATCACGTAGGACT 149 [39]
引物长度一般在20～30 bp, 扩增产物在50～300 bp。
如图1 所示, 扩增片段长度多集中于50～150 bp, 更多的在
100 bp 左右, 用于临床检测的引物产生的片段都大于200
bp[18,19]。这说明经过多重精炼工艺加工的油脂中所含的基
因破坏程度高, 与其他荧光PCR 技术应用对象相比, 基因
模板片段更短, 但结构稳定, 最终被保留于油脂中, 可作
为PCR 应用依据。
通常荧光定量PCR 的反应程序需经过94 ℃预变性5
min 后, 94 ℃ 30 s; 50 ℃ 60 s; 72 ℃ 40 s; 运行40 个循环,
72 ℃延伸5 min。退火温度是反应过程至为重要的环节, 合
适的退火温度可保证模板不断增量, 产生荧光值, 因此本
文对比了植物物种与其他物种的退火温度, 为将来实时荧
光PCR 应用于油脂检测提供参考依据, 见图2。
图2 退火温度对比
Fig. 2 Comparison of annealing temperature
(系列1: 其他物种退火温度; 系列2: 植物物种退火温度; 图中样
本选自本文列出的引物反应条件。)
分别列取了10 种植物物种和其他物种的退火温度,
从图线趋势看出, 大部分退火温度在60 ℃附近, 系列2 曲
线位于系列1 下方, 表现出温度降低, 这是由于相应的降
低退火温度可增加扩增产量, 而油脂中残留的DNA 模板
整体质量不高, 适当的减低退火温度利于荧光值产生, 但
过度降低会造成非特异性扩增, 使结果呈现假阳性。因此
在引物设计时, 保证引物长度在25 bp, 扩增产物长度在
100 bp, 退火温度在55～60 ℃, 可有效达到扩增目的。
4 荧光定量PCR 在油脂检测中的具体应用
4.1 油脂中动物成分检测
在检测植物油脂中的动物源成分时, 王立平等[40]建
立的方法可有效检测猪油-大豆油(质量分数1%)中的猪油
成分, 并确定提取液选择TE 缓冲液, 振摇时间不得低于
10 min, 要求油样体积至少20 mL。范丽丽等[36]建立了对
市售产品中牛源性成分的检测方法, 其荧光探针法检测体
系的检测限低至0.5%, 可检测1 pg 牛源DNA 的存在, 设
计引物的扩增片段为91 bp, 可为油脂中动物成分检测提
供依据。
4.2 油脂中转基因成分检测
在油脂中检测转基因成分时, 传统方法采用CTAB、
SDS 裂解液预处理油样, 水相提取液水浴65 ℃、30 min
万方数据
530 食品安全质量检测学报 第8 卷
后加入沉淀剂。闻伟刚等[41]建立的DNA 提取方法和试剂
盒提取效果相当, 最终经过PCR 鉴定, 检测出每毫升大豆
原油中的核酸含量为2×10-5 ng。但试剂盒价格较高, 不利
于基层检测工作开展。陈颖等[42]通过模拟转基因食用油,
分别提取转基因大豆和非转基因大豆的DNA 添加于大豆
油中, 建立的方法可检测出0.01%的转基因成分。
4.3 植物油脂中其他类植物油脂成分检测
周慧等[43]利用实时荧光定量PCR 方法检测花生油中
掺入的棕榈油成分, SN/T 1203-2010 提取油脂中DNA, 当
掺入的棕榈含量达到5%时, 花生油中检出棕榈成分
17.431 copies/mL, 含量在3.19 ng 左右。此方法将棕榈中
提取的核酸混入到花生油中, 模板破坏程度低, 不能完全
模拟棕榈油, 但在实际运用中可将此法作为参考。油脂制
备原料状态对荧光检测结果的灵敏度也有影响, 以花生为
例, 经过部分脱水后的花生其核酸提取率要高于生花生,
同理通过冷榨技术或浸提法的花生油其核酸残留量低, 实
验模拟当大豆油中的花生油含量低于20%时便不能被检出
混入的花生成分[23]。
5 结果分析
5.1 样品处理条件确定
实时荧光定量PCR 技术用于食用油脂成分检测为油
脂品控提供了参考依据。改良CTAB 法对油脂中DNA 的
提取效果较好, 以CTAB 缓冲液为提取液, 油样体积不少
于20 mL, 每次振摇时间不少于10 min, 高速离心使得
DNA 溶解于水相后, 冷冻过夜并结合DNA 提取试剂盒进
行DNA 纯化, 离心过柱浓缩DNA 提取液。通常认为, 提
取液体积越大, 油样越多, 提取到DNA 的可能性就越高。
但当提取液体积大于10 mL 时, 过离心柱(约1 mL 容量)
的次数增加, 耗时也相应增加, 往往会造成DNA 损失; 而
减少提取液体积, 多次混合振荡后, 离心分层后水相会伴
随油样被吸出, 最终的提取液中所溶解的DNA 量会有所
降低。对于水油混合可采用摇床振荡和磁力搅拌的方法,
促进油脂中DNA 溶于提取液。精炼食用油500 mL, 用
1000 mL PBS 缓冲液可提取出0.4 μg DNA[44]。
5.2 引物设计
根据已报道的NCBI 号, 可查找相应的基因序列, 通
过设定条件产生的引物序列可能被PCR 所用。设计引物碱
基数不宜过多, 避免引物二聚体产生, 扩增产物不宜过小,
否则易产生假阳性。根据油脂DNA 的特点, 为了达到良好
PCR 扩增效果, 引物设计长度应在25 bp, 产物大小为100
bp, 设定退火温度为55～60 ℃。
5.3 结果判断
与传统PCR 技术相比, 实时荧光定量PCR 技术具有
特异性强、重复性好、定量准确、PCR 污染少和自动化程
度高等优点[45]。整个PCR 过程可通过扩增曲线实时监控,
产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系, 可实现
定量分析。
常规PCR 以电泳结果为准, 将扩增条带与DNA
Marker 分子量标准对比, 一般认为在对应的分子量区有条
带产生, 则说明扩增成功。荧光定量PCR 技术以扩增曲线
为判断准则, 可进行绝对定量和相对定量。绝对定量可准
确测出DNA含量, 判断结果准确, 而相对定量法中主要以
Ct 值判断, 通常当Ct＞40 时, 结果为阴性; Ct 值＜36 时,
结果为阳性; 36＜Ct＜40 时, 实验应重复后再判断结果。无
论是绝对定量还是相对定量, 直观的曲线信息可减少实验
误差。常用的荧光定量PCR 方法主要有染料法和探针法。
在染料法中, 荧光染料不存在特异性, 仅识别DNA分子中
双键, 对产生的二聚体等非特异性产物也有荧光信号, 结
果易有假阳性; 而探针法中所设计的核酸探针仅特异性扩
增某段区域, 其结果更为可靠。目前国家标准中也多采用
探针法进行定量。
6 总 结
食用油脂中核酸片段小、纯度低, 但经过长期试验证
明荧光定量PCR 技术可实现油脂品质控制, 尤其是食用原
油。现已建立的油脂DNA 提取方法使DNA 质量在pg 级
也可满足荧光定量PCR 的要求; 但在DNA 提取中存在着
影响PCR 过程的因素如酚类、醇类等残留, 应充分除去以
确保DNA 纯度。此外, 对于精炼程度高的油脂需要大量原
料富集, 且提取液的量也会相应增加, 适当次数的离心过
柱可有效提取其中的核酸, 应设计较大容量的离心柱。同
时合适的引物也是PCR 过程必不可少的。不少植物物种已
经公布全序列基因信息, 可选择代表物种属性且稳定性高
的基因区间作为设计引物依据, 引物不宜过长, 避免二聚
体产生, 同时不断丰富引物信息, 真正实现采用荧光定量
PCR 技术对食用油脂的安全监控。
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(责任编辑: 姚 菲)
作者简介
刘鹏飞, 硕士研究生, 学士, 主要研究
方向为食品安全检测技术、天然活性物质。
E-mail: 1163245636 @qq.com
李 健, 副教授, 主要研究方向为
食品安全、食品生物技术、天然化合物。
E-mail: lijian2013@jmu.edu.cn.

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