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分子印迹固相萃取-分光光度法检测环境水样中的孔雀石绿

文档作者：董建伟杨军亭侯清娥付宏岐蒋宝薛萍文档来源：渭南职业技术学院		点击数：	更新时间： 2025年06月08日
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第4 卷第 4 期食 品安全质量检测学报Vol. 4 No. 4
2013 年8 月Journal of Food Safety and Quality Aug. , 2013
基金项目: 渭南职业技术学院院级科研项目(WZYY201315)
Fund: Supported by College-Level Research Projects of Weinan Vocational and Technical College (WZYY201315)
*通讯作者: 董建伟, 助教, 主要研究方向为食品污染物检测。E-mail: dongjianwei1305@163.com
*Corresponding author: DONG Jian-Wei,Teaching Assistant, Weinan Vocational and Technical College, West of Shengli Street, High-Tech
District, Weinan 714000, China. E-mail: dongjianwei1305@163.com
分子印迹固相萃取-分光光度法检测
环境水样中的孔雀石绿
董建伟*, 杨军亭, 侯清娥, 付宏岐, 蒋宝, 薛萍
(渭南职业技术学院, 渭南 714000)
摘要: 目的建立分子印迹固相萃取-分光光度法检测水样中孔雀石绿的方法。方法以孔雀石绿(MG)为模
板分子, 甲基丙烯酸(MAA)为功能单体, 乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂, 以本体聚合方法制备的
分子印迹聚合物为填料自制固相萃取柱。对固相萃取的上样溶剂、干燥方法、淋洗溶剂等条件进行了优化。
采用优化的条件对自来水和河水加标水样中的孔雀石绿进行萃取, 再用分光光光度计检测。结果自来水和河
水水样加标浓度在8∼128 μg/L 范围内得到的回收率分别为86.3%∼92.1%和83.5%∼90.3%。结论 本方法操作
简单、灵敏度高, 适用于环境水样中孔雀石绿的痕量检测。
关键词: 孔雀石绿; 分子印迹聚合物; 固相萃取; 分光光度计
Determination of malachite green in environmental water samples by
spectrophotometry with molecularly imprinted solid phase extraction
DONG Jian-Wei*, YANG Jun-Ting, HOU Qing-E, FU Hong-Qi, JIANG Bao, XUE Ping
(Weinan Vocational and Technical College, Weinan 714000, China)
ABSTRACT: Objective To establish a method for determination of malachite green in water samples by
spectrophotometry with molecularly imprinted solid phase extraction. Methods The solid phase extraction
column was made using molecularly imprinted polymer as filler. The molecularly imprinted polymer was prepared
by bulk polymerization using malachite green (MG) as template, methacrylic acid (MAA) as functional
monomer, ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) as cross linking agent. The extraction conditions, such as
sample solvents, drying methods, and elution solvents, were optimized. MG in tap and river water samples were
detected by spectrophotometer under the optimized conditions. Results The recoveries were in a range of
86.3%∼92.1% and 83.5%∼90.3% respectively when the spiked concentration in tap and river water samples in
the range of 8∼128 μg/L. Conclusion The method is simple, sensitive and it is suitable for the detection of
malachite green in environmental water.
KEY WORDS: malachite green; molecularly imprinted polymer; solid phase extraction; spectrophotometer
第4 期董建伟, 等: 分子印迹固相萃取柱-分光光度法检测环境水样中的孔雀石绿 1201
1 引 言
孔雀石绿(malachite green, MG)最初作为染色剂
用于纺织行业, 由于其价格低廉和高效的抑菌作用,
近几十年来被广泛用于渔业[1]。但是, 一些研究表明
孔雀石绿具有致癌、致畸和致突变的作用[2-5], 在美
国、欧洲和其他许多国家孔雀石绿在渔业中是禁止使
用的[6]。然而, 在我国, 渔业中非法使用孔雀石绿的
现象极为普遍。
目前, MG 的测定方法主要是高压液相色谱法
(HPLC)[7-8]和液相色谱串联质谱法(LC-MS)[9-12]等。尽
管这些方法准确且具有高的灵敏度, 但是存在仪器
昂贵, 需要专业的操作人员以及前处理过程费时等
不足。对样品的前处理是通过直接液液萃取[13-14], 固
相萃取[7,15]等技术, 所用的固相萃取柱类型不同其萃
取得率差异较大。环境科学中吸附孔雀石绿的材料有
经化学热处理的脱脂豆粕、锯屑、稻壳及草木灰等,
这些材料都缺乏吸附特异性。
分子印迹技术(molecularly imprinted technology)
是最近几十年来发展起来的一种功能高分子合成技
术, 旨在合成像抗原抗体一样对目标物有特异性吸
附的高分子材料, 故也被称作是“人工抗体”。与常规
的分离分析介质相比, 分子印迹聚合物具有高度的
选择性; 与抗原抗体等具有选择性的生物分子相比,
分子印迹聚合物具有物理化学稳定性, 耐受高温高
压、酸碱、有机溶剂等。由于其突出的优点, 分子印
迹聚合物被广泛应用于固相萃取、色谱分离、仿生传
感器、模拟酶催化等方面。本研究采用分子印迹固相
萃取柱提取环境水样中孔雀石绿, 再用分光度计进
行检测, 建立分子印迹固相萃取-分光光度法检测水
样中孔雀石绿的方法。
2 材料与方法
2.1 实验材料
孔雀石绿(MG)、亮绿(bright green, BG)、结晶紫
(crystal violet, CV)和甲基紫(methyl violet, MV)均为
分析纯, 购于天津福晨化学试剂厂; 甲基丙烯酸
(methacrylic acid, MAA)和乙二醇二甲基丙烯酸酯
(ethylene glycol dimethacrylate, EGDMA)购于美国
Sigma 公司; 偶氮二异丁腈(azobisisobutyronitrile,
AIBN)购于天津大茂化学试剂厂; 甲醇和冰醋酸购于
天津福晨化学试剂厂; 乙腈为色谱纯, 购于浙江黄岩
化学实验厂。
AL-204 型电子分析天平(美国梅特勒-托利多);
SY-1-2 电子恒温水浴锅(天津欧诺仪器仪表有限公
司); 电热真空干燥箱(天津天宇机电有限公司);
TLL-C 台式高速冷冻离心机(军事医学科学院四环仪
器厂); TDL-80-2B 低速台式离心机(上海安亭科学仪
器厂); KQ-200KDV 超声波清洗机(江苏昆山市超声
仪器有限公司); TU-1901 型紫外分光光度计(北京普
析通用仪器有限公司)。
2.2 实验方法
2.2.1 分子印迹固相萃取柱的制备
准确称取 0.365 g MG 于10 mL 比色管中, 加入
0.34 mL MAA 和5 mL 乙腈, 超声混匀5 min 后置于
4 ℃冰箱中过夜。然后加入3.8 mL EGDMA 和40 mg
AIBN, 超声除气5 min, 通氮除氧12 min 后立即密封,
放入恒温水浴中60 ℃热引发聚合24 h。得到的块状
物用研钵研磨, 过筛, 收集直径大小为38.5∼74 μm
的颗粒聚合物。用甲醇/冰乙酸(9/1)溶液作为溶剂, 索
式提取MIPs 中的模板分子, 定期检测流下液中孔雀
石绿的含量, 直到检测不到模板分子为止。然后用甲
醇洗涤MIPs 颗粒至中性(洗去冰乙酸), 再用乙腈洗
涤三遍平衡聚合物形态。最后置于电热真空干燥箱中
干燥24 h(48 ℃, 0.1 MPa)。非印迹聚合物(NIPs)的制
备方法与MIPs 相同, 只是不加模板分子, 制备的
MIPs 和NIPs 干燥粉末保存备用。
分别称取 300 mg MIPs 和NIPs 干燥粉末装入2
mL 蓝心玻璃注射器中(7.7 cm×0.8 cm i.d.), 上下都是
由脱脂棉压紧的垫片作为挡板, 制得分子印迹和非
印迹固相萃取柱(MIPs-和NIPs-SPE), 最后安装到固
相萃取仪上进行固相萃取研究。
2.2.2 固相萃取条件优化
2.2.2.1 上样溶剂选择
拟选择五种溶剂(甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷、
纯水和乙腈)为上样溶剂。安装好固相萃取装置, 依
次用5 mL 甲醇/冰乙酸(9/1)、5 mL 甲醇和4 mL 上
样溶剂活化柱子, 流速为1 mL/min。然后上样, MG
的上样浓度为2000 μg/L, 上样体积为2 mL, 流速控
制为1 mL/min。收集上样流出液, 干燥浓缩后定容测
定。同时剩余2 mL 上样液放置12 h 后用分光光度计
测定, 观察MG 在其溶液中的稳定性。计算回收率。
1202 食品安全质量检测学报第 4 卷
= ×100% 测定量
回收率
初始量
2.2.2.2 干燥方式选择
实验中发现干燥方式的不同会使溶液中保留的
MG 量不同, 因此比较了25 ℃电热真空干燥和35 ℃
氮吹干燥对MG保留量的影响。配制浓度分别为500、
1000、2000 μg/L 的MG 溶液5 mL, 所用溶剂为固相
萃取研究中拟用的淋洗和洗脱溶剂(乙腈、二氯甲烷、
氯仿、甲醇、0.5%冰乙酸乙腈和10%冰乙酸甲醇)。
每种溶液取1 mL 于10 mL Eppendorf 管中, 分别置
于电热真空干燥箱中干燥至干(25 ℃, 真空度0.08
MPa) 和35℃ 氮吹干燥至干。最后向干燥好的
Eppendorf 管中分别加入0.5 mL 色谱乙腈, 静置15
min, 再超声5 min, 使Eppendorf 管中MG 完全溶于
溶剂, 然后再用分光光度计测定。计算回收率。
2.2.2.3 淋洗溶剂选择
分 别 测 试 冰 乙 酸 / 乙腈(v/v) 混合溶液(0% 、
0.25%、0.5%、0.75%和1%)作为淋洗液时样品的回
收率。安装好固相萃取装置, 依次用5 mL 甲醇/冰
乙酸(9/1)、5 mL 甲醇和4 mL 纯水活化柱子, 流速
为1 mL/min。然后上样2 mL 1000 μg/L 的MG 水
溶液, 3 mL 淋洗液淋洗, 3 mL 甲醇/冰乙酸(9/1)洗
脱。萃取过程流速控制为1 mL/min, 收集每步的流
出液, 吸干后再进行下步操作。最后干燥淋洗液和
洗脱液, 用0.5 mL 色谱乙腈定容后, 用分光光度计
测定回收率。
2.2.3 MIPs-SPE 重复再生性评价
装填一只新的固相萃取柱, 安装在固相萃取
装置上, 依次用5 mL 甲醇/冰乙酸(9/1)、5 mL 甲醇
和4 mL 纯水活化柱子, 流速为1 mL/min。然后上
样2 mL 1000 μg/L 的MG 纯水溶液, 3 mL 优化的淋
洗液淋洗, 3 mL 甲醇/冰乙酸(9/1)洗脱。萃取过程
流速控制为1 mL/min, 收集洗脱液, 吸干后再进行
下次重复加样萃取实验, 共重复8 次。最后将8 次
的洗脱液干燥, 用0.5 mL 乙腈定容后, 用分光光度
计测定回收率。
2.2.4 实际样品的测定
实际样品为自来水样和河水, 自来水来自天津
和平区大理道, 河水取自为天津海河, 加标前均未检
出孔雀石绿。
自来水和河水加标浓度分别为 8、16、32、64、
128 μg/L, 取20 mL 加标水样, 过0.45 μm 滤膜后直
接上样过柱, 采用优化的固相萃取条件, 最后用分光
光度计测定孔雀石绿的量, 计算回收率(n=3)。
3 结果与分析
3.1 确定最大吸收波长
用孔雀石绿标准物质配制成浓度为 1000 μg/L 的
孔雀石绿乙腈标准溶液, 在300∼800 nm 范围内扫描
其吸收光谱, 得出溶液的最大吸收峰位于618 nm 处,
故选择618 nm 测定波长。通过采用分光光度计对一
系列孔雀石绿标准溶液进行测定, 得出孔雀石绿浓
度C 在100∼5000 μg/L 范围内与吸光度A 均具有良好
的线性关系, 校准曲线的回归方程为
A=0.000173C(μg/L)+0.002, 相关系数为R=0.9989。
3.2 固相萃取条件优化
3.2.1 上样溶剂选择
上样溶剂的选择, 一般遵循的原则是在可能溶
解的情况下尽量选择弱极性的溶剂。这样可以保证样
品在固相萃取柱上较好地吸附, 不被极性强的溶剂
在上样过程中洗脱下来。实验发现, MG 在不同溶液
中稳定性不同, 结果见图 1。由图1 可知, 溶于纯水
的MG 在12 h 后损失很小, 溶于乙腈后几乎不损失,
适于用作上样溶剂; 而溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿的
MG 损失很大, 不适于用作上样溶剂。就穿透率而言,
乙腈和纯水最小, 二氯甲烷也很小, 甲醇和氯仿要大
很多(图2)。综合两种结果, 选择乙腈或纯水为上样
溶剂。
图 1 MG 在不同溶剂中的稳定性
Fig. 1 The stability of MG in the different solvents
第4 期董建伟, 等: 分子印迹固相萃取柱-分光光度法检测环境水样中的孔雀石绿 1203
图2 溶剂上样的穿透率
Fig. 2 The penetration rate of sample volume using
different solvents
3.2.2 干燥方式选择
一定量的 MG 上样后, 收集各个步骤的流出液,
25 ℃真空干燥后定容测定, 回收率总在50%左右,
说明操作过程存在问题。干燥过程应该是最重要的因
素。因此, 探索了不同溶剂中的MG 经过不同干燥方
式处理后所得的回收率情况。所选的溶剂都是固相萃
取研究中可能用到的溶剂。结果见图3 和图4。从整
体来讲, 35 ℃氮吹干燥要比25 ℃真空干燥的效果
好。尤其是当溶剂为10%冰乙酸甲醇溶液时, 35 ℃氮
吹干燥要比25 ℃真空干燥的效果好很多。对于分子
印迹固相萃取柱来说目标物最后富集于洗脱液中,
即本研究中的孔雀石绿最后富集于10%冰乙酸甲醇
溶液中。这就可以解释用25 ℃真空干燥时回收率总
是在50%左右的原因了, 采用25 ℃真空干燥时, 大
量的MG 在洗脱液中降解了。35 ℃氮吹干燥要比
25 ℃真空干燥的效果好的原因主要是干燥时间的不
同。35 ℃氮吹干燥大约用时20 min, 而25 ℃真空干
燥要6∼7 个小时。用时短可以保证不稳定的MG 没
有变化。本实验最初用的是40 ℃真空干燥, 回收率
很低。考虑到温度可能会破坏MG, 于是将温度设定
为25 ℃进行真空干燥, 回收率没有明显变化。本实
验也比较了采用两种干燥方式做固相萃取研究的总
回收率(图 5)。结果显示: 35 ℃氮吹干燥的回收率远
高于25 ℃真空干燥, 而且35 ℃氮吹干燥的回收率能
够达到检测的标准。最终确定干燥浓缩的方式为
35 ℃氮吹干燥。
3.2.3 淋洗液选择
淋洗条件对于分子印迹固相萃取柱至关重要。
图 3 25 ℃真空干燥的回收率
Fig. 3 Recoveries of malachite green using vacuum dry at 25 ℃
1204 食品安全质量检测学报第 4 卷
图 4 35 ℃氮吹干燥的回收率
Fig. 4 Recoveries of malachite green using nitrogen stream dry at 35 ℃
图5 不同干燥方式的总回收率
Fig. 5 The total recoveries of malachite green with different
drying methods
MG 对于NIPs 柱是非特异结合物, 而对于MIPs 柱是
特异性结合物, 淋洗液是把MIPs 柱上的非特异结合
物洗掉, 而不能把特异性结合物(模板分子)洗掉, 这
就要求淋洗液的极性在一个合适的范围内。极性太小,
非特异性结合物质不能被洗脱下来; 极性太大, 所要
的特异性结合物也会被洗脱下来。本实验采用增加乙
腈中冰乙酸的含量来调节淋洗液的极性。NIPs 柱和
MIPs 柱同时上样2 mL 1000 μg/L MG 溶液, 用3 mL
不同极性的淋洗液淋洗, 分别测定NIPs 柱和MIPs
柱的淋洗流出液。实验结果见图6。随着乙腈中冰乙
酸含量的增加, NIPs 柱淋洗流出液中MG的含量逐渐
增加, MIPs 柱淋洗流出液中MG 的含量也在增加。当
乙腈中含1%冰乙酸时, NIPs 柱中约90%的MG 被洗
下, 而MIPs 柱中只有5%左右的MG 被洗下, 这一淋
洗条件是符合要求的。而当乙腈中冰乙酸含量减少为
0.75%时, NIP 柱中约70%的MG被洗下, 当乙腈中冰
乙酸含量增加为1.25%时, MIP 柱中有10%的MG 被
洗下, 此条件下, 达不到淋洗要求。最终确定淋洗条
件为含1%冰乙酸的乙腈溶液。
3.3 MIPs-SPE 再生性评价
传统的非特异性固相萃取柱用到三次以上效果
就会变差, 所以要验证一下分子印迹固相萃取柱这
种特异的固相萃取柱的重复再生性。连续8 次使用的
结果见图 7。由图7 可知, MIPs-SPE 用8 次后回收率
并没有下降。结果表明分子印迹固相萃取柱可以使用
多次, 重复再生性好。
3.4 实际样品测定
水样实际样品测定结果见表 1。
由表 1 可知: 采用分子印迹固相萃取-分光光度
法检测自来水和河水加标样品时, 加标浓度在
8∼128 μg/L 范围内具有较好的回收率, 说明分子印
第4 期董建伟, 等: 分子印迹固相萃取柱-分光光度法检测环境水样中的孔雀石绿 1205
图6 淋洗条件对MG 含量的影响
Fig. 6 Effect of elution conditions on the recovery of MG
in MIP and NIP columns
图 7 MIPs-SPE 重复再生性
Fig. 7 Reproducibility of the MIPs-SPE
表1 水样加标检测回收率(n=3)
Table 1 Recoveries of water spiked with MG(n=3)
水样
加入量
(μg/L)
测得平均值
(μg/L)
平均回收率
(%)
自来水
8 7.08 88.5
16 14.60 91.3
32 29.48 92.1
64 57.37 89.6
128 110.40 86.3
河水
8 6.79 84.9
16 14.45 90.3
32 28.76 89.9
64 55.92 87.4
128 106.94 83.5
迹固相萃取柱可以用于水样中痕量孔雀石绿的分离
富集, 也说明分子印迹固相萃取-分光光度法适用于
环境水样中孔雀石绿的痕量检测。
4 讨 论
本研究制备了MG 的分子印迹聚合物, 并以此
为填料自制了固相萃取柱。对固相萃取的上样溶剂、
干燥方法、淋洗溶剂等条件进行了优化。在最优条件
下对自来水和河水加标水样中的孔雀石绿进行萃取,
再用分光光光度计检测, 方法简单易行, 为分子印迹
固相萃取柱在孔雀石绿其他检测方面的应用奠定了
基础。
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(责任编辑: 张宏梁)
作者简介
董建伟, 助教, 主要研究方向为食品
污染物检测。

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