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化学发光免疫分析方法在食品安全检测中的研究进展

文档作者：金茂俊王静杨丽华杜鹏飞邵华金芬王珊珊文档来源：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所农业部农产品质量安全重点实验室		点击数：	更新时间： 2025年06月06日
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上一篇：化学技术在食品安全检测中的应用

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第5 卷 第3 期 食品安全质量检测学报 Vol. 5 No. 3
2014 年3 月 Journal of Food Safety and Quality Mar. , 2014
基金项目: 国家公益性行业(农业)科研专项(201203094)、国家国际科技合作专项资助(2012DFA31140)、吉林省世行贷款农产品质量安全
项目(2011-Z50)
Fund: Supported by Public-interest industrial Science &amp;amp; Technology Project (201203094), International Science &amp;amp; Technology Cooperation
Program of China (2012DFA31140) and World Bank Loan Project in Jilin Provincial Agro-products Quality &amp;amp; Safety Project (2011-Z50)
*通讯作者: 王静, 教授, 主要研究方向为食品安全检测技术。E-mail: w_jing2001@126.com
*Corresponding author: WANG Jing, professor, Institute of Quality Standards &amp;amp; Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of
Agricultural Sciences, No. 12, Southern Street of Zhongguancun, Haidian District, Beijing 100081, China. E-mail: w_jing2001@126.com
化学发光免疫分析方法在食品安全检测中的
研究进展
金茂俊, 王 静*, 杨丽华, 杜鹏飞, 邵 华, 金 芬, 王珊珊, 佘永新
(中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所, 农业部农产品质量安全重点实验室, 北京 100081)
摘要: 化学发光免疫分析方法作为一项具有高特异性和高灵敏度的免疫分析方法, 经过近几十年的发展, 目前
已在食品安全检测领域得到了良好的应用。本文根据不同化学发光免疫分析方法所选择标记物的不同, 将化学发
光免疫分析方法分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析三个类别, 并对各方法常用
的化学发光标记物及分析方法原理进行介绍。同时, 综述了化学发光免疫分析方法在农兽药残留、生物毒素、违
禁添加物及微生物检测方面的应用进展情况。随着化学发光免疫分析方法在新型化学发光标记物及化学发光增敏
体系方面取得进一步的研究进展, 其在食品安全检测领域必将得到更为广泛的应用。
关键词: 化学发光免疫分析; 食品安全; 研究进展
Latest progress of chemiluminescent immunoassay in food safety detection
JIN Mao-Jun, WANG Jing*, YANG Li-Hua, DU Peng-Fei, SHAO Hua, JIN Fen,
WANG Shan-Shan, SHE Yong-Xin
(Key Laboratory for Agro-Products Quality and Safety of Ministry of Agriculture, Institute of Quality Standards &amp;amp; Testing
Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)
ABSTRACT: Chemiluminescent immunoassay (CLIA) as the technology with high specificity and sensitivity,
after decades of development, has got a good application in the field of food safety detection. According to the
different labelled substances used in the CLIA system, the methods were divided into CLIA, chemiluminescent
enzyme immunoassay (CLEIA) and electrochemiluminescent immunoassay (ECLIA). This review briefly described
the classical chemiluminescent labelled substances and the principles of various CLIA systems. Meanwhile,
the application of CLIA in the detection of pesticide residue, veterinary drug residue, biological toxins,
prohibited addictives, and microorganisms were introduced. Accompanied with the further development of
CLIA applied in novel chemiluminescent labelled substances and sensitized system, the technology will have a
prosperous future in detection of food safety.
KEY WORDS: chemiluminescent immunoassay; food safety; research progress
第3 期 金茂俊, 等: 化学发光免疫分析方法在食品安全检测中的研究进展 841
化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发
射。其发光机理是: 反应体系中的某些物质分子, 如
反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量
而由基态跃迁到激发态, 当中间体由激发态回到基
态时会, 释放等能量的光子, 对光子进行测定而实现
定量分析[1]。化学发光免疫分析方法是将化学发光与
免疫分析相结合的方法, 具有灵敏度高、特异性强、
线性范围宽、成本底、操作简单、应用广泛、检测时
间短、易于实现自动化且无放射性污染等优点[2], 已
在食品安全检测领域得到越来越广泛的应用。
1 化学发光免疫分析方法的类别
根据化学发光免疫分析体系中所选标记物的不
同, 将化学发光免疫分析方法分为化学发光免疫分
析、化学发光酶免疫分析及电化学发光免疫分析三
大类。
化学发光免疫分析是用化学发光标记物质直接
标记抗体或抗原的一类免疫分析方法。作为化学发光
标记物, 目前使用最多的是鲁米诺类和吖啶酯类这
两类物质。(1)鲁米诺类物质标记的化学发光为氧化
反应发光。在碱性环境中, 鲁米诺可被许多物质氧化
发光, 其中过氧化氢(H2O2)最为常用。为了提高化学
发光反应速率, 需向这一反应体系中添加某些酶类
或无机催化剂。催化用的酶类主要选择辣根过氧化物
酶(HRP), 无机催化剂主要包括O3、卤族元素及Fe3+、
Cu2+、Co2+和它们的配合物。(2)吖啶酯类物质标记的
化学发光是在碱性环境中, 吖啶酯类物质被H2O2 氧
化, 迅速产生光子, 具有很好的量子产率。将吖啶酯
类物质作为化学发光免疫分析的化学发光标记物,
具有发光体系简单、反应速率快、无需催化剂、标记
效率高、发光本底低等优点。
化学发光酶免疫分析是用酶标记抗原或抗体的
一类化学发光免疫分析方法。酶标记抗原或者抗体进
行特异性免疫反应后, 免疫反应复合物上的酶催化
化学发光底物在信号试剂作用下发光。目前应用最为
广泛的标记酶是HRP 和碱性磷酸酶(ALP), 这两种酶
都有各自的发光底物。HRP 最常用的发光底物是鲁
米诺及其衍生物。在化学发光酶免疫分析中, 使用
HRP 标记抗体或抗原, 免疫反应后, 将鲁米诺作为
发光底物, 在碱性环境及HRP 存在下, 鲁米诺被
H2O2 氧化发光, HRP 的浓度决定了化学发光的强度。
这一传统的化学发光体系(HRP- H2O2-鲁米诺)为持
续几秒的闪光型发光, 存在发光强度低、不易测量等
缺点。在这一化学发光反应体系中加入化学发光增强
剂, 可大大增强发光信号, 并在较长的时间内保持发
光稳定, 从而提高这一化学发光反应体系的分析灵
敏度和准确性。ALP 最常用的发光底物是1,2-二氧环
已烷类物质。这类化学发光体系中最为经典的是
Bronstein 等提出的3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-
磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)-ALP
发光体系。这一化学发光反应体系的特点是反应速度
快, 短时间可提供检测结果。
电化学发光免疫分析是将电化学发光与免疫分
析相结合的一类化学发光免疫分析方法。电化学发光
是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光
反应。电化学发光与化学发光的差异在于电化学发光
是电启动发光反应, 而化学发光是通过化合物混合
起动发光反应, 因此电化学发光反应易精确控制。电
化学发光免疫分析最常用的发光底物是三联吡啶钌
[Ru(byp)3
2+], 三丙胺(TPA)用来激发这个体系的发光
反应。在阳极表面, Ru(byp)3
2+ 和TPA 同时失去电子,
Ru(byp)3
2+被氧化成Ru(byp)3
3+, TPA 被氧化成阳离子
自由基(TPA+ *), TPA+ *将自发地释放一个质子而变
成非稳定分子(TPA*), 并将一个电子传递给
Ru(byp)3
3+, 形成激发态的Ru(byp)3
2+ *, Ru(byp)3
2+ *在
衰减的同时发射一个波长为620 nm 的光子, 重新回
到基态Ru(byp)3
2+。这一反应过程在电极表面反复进
行, 从而产生高效、稳定的连续发光, 发光强度不断
增强。
2 化学发光免疫分析方法在食品安全检测
中的应用
1977 年, Halman 等[3]首先将化学发光与免疫分
析方法相结合, 建立了化学发光免疫分析方法, 实现
了对微生物的检测。自此以后, 化学发光免疫分析方
法在医学检测领域被大量成功应用[4-10]。近年来, 化
学发光免疫分析方法受到食品安全研究领域科研人
员的极大关注, 实现了其对农兽药残留、生物毒素、
违禁添加物和微生物的高灵敏度检测。
2.1 在农兽药残留检测中的应用
在农药残留检测方面, Schlaeppi 等[11]将化学发
光免疫分析方法应用于农药残留检测, 利用磁性物
质与化学发光免疫分析方法相结合, 实现了醚苯磺
842 食品安全质量检测学报 第5 卷
隆的快速检测, 其在水样中的检测限为0.02 ng/mL,
并将建立的化学发光免疫分析方法与液相色谱法进
行了比较研究, 结果显示其有着较好的相关性(R2=
0.96)。1999 年, Samsonova 等[12]基于三氮苯类除草剂
的混合抗体, 建立了阿特拉津、草净津和莠灭净等三
种除草剂的多残留免疫分析方法, 方法回收率为
70%~100%。2003 年, Alexandra 等[13]基于酶联免疫和
化学发光酶免疫法, 分别建立了DDT 及其代谢物的
两种免疫分析方法, 并对食物样品中的DDT 及其代
谢物进行检测。结果显示: 建立的酶联免疫法IC50
值为0.6 ng/mL, 而化学发光酶免疫法的IC50 值为0.2
ng/mL。Barbora 等[14]基于化学发光酶免疫分析, 建立
了氨基甲酸酯类农药的化学发光免疫分析方法, 实
现对克百威、甲萘威和灭虫威的检测, 三种物质的检
测限分别为0.03 ng/mL、0.007 ng/mL 和0.004 ng/mL。
2012 年, 王静等[15]研究建立了三唑磷农药的化学发
光酶免疫分析方法, 该方法的线性检测范围为
0.04~5 ng/mL, 最低检测限为0.063 ng/mL, 对生菜、
胡萝卜、苹果、水和土壤的添加回收率分别为
78.71%、67.52%、118.3%、117.2% 和122.0%。
在兽药残留检测方面, Lin 等[16]基于化学发光免
疫分析方法, 实现了对食品中氯霉素的检测, 其方法
灵敏度为0.05 ng/mL, 且方法的精密度、特异性及准
确度等指标均与酶联免疫分析方法相当, 十个样品
的板内和板间变异系数分别小于8%和20%, 样品的
添加回收率87%~100%。Wutz 等[17]基于化学发光免
疫分析方法, 建立了蜂蜜中恩诺沙星、磺胺二甲基
嘧啶、磺胺嘧啶和链霉素的多残留检测方法。Tao
等[18]基于化学发光酶免疫分析, 建立了氟苯尼考
及其代谢产物氟苯尼考胺的免疫分析方法, 鸡肉
中氟苯尼考的检测限为0.526 ng/mL, 添加回收率
为71.8%~102%, 氟苯尼考胺的检测限为0.453
ng/mL, 添加回收率为70.3%~100%。2013 年, Tao
等[19]通过将氯霉素和氟苯尼考的抗体相混合, 建
立了可同时检测火腿肠中氯霉素、氟苯尼考及其代
谢物氟苯尼考胺的化学发光酶免疫分析方法, 该方
法氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的检测限分别为
0.01、2.8、3.0 μg/kg。
因目前国际食品法典委员会及我国主要贸易国
对农兽药残留的最大残留限量值(MRL)标准的制定
日趋严格, 且农畜产品中可能存在的农兽药多残留
现象, 使得化学发光免疫分析方法在农兽药残留检
测方面朝着高灵敏度和多残留检测方向发展。因化
学发光免疫分析方法本身存在高灵敏的优点, 该方
法在农兽药残留检测方面的研究将会进一步拓展和
深化。
2.2 在生物毒素检测中的应用
Quan 等[20]基于化学发光酶免疫分析, 建立了食
品中伏马菌素B1 的免疫分析方法, 该方法的线性范
围为0.14~0.9 μg/L, 方法的灵敏度(以IC50 衡量)为
0.32 μg/L, 方法的最低检测限(以IC10 衡量)为0.09
μg/L, 与建立的伏马菌素B1 酶联免疫分析方法相比,
其方法检测灵敏度提高10 倍, 且回收率满足相关要
求。Magliulo 等[21]基于化学发光酶免疫分析, 建立了
牛奶中黄曲霉毒素M1 的免疫分析方法。通过将黄曲
霉毒素M1-牛血清白蛋白(BSA)的偶联物包被在聚丙
烯固相载体上, 加入黄曲霉毒素M1 抗体和待测样品,
竞争反应后, 加入酶标二抗, 实现对黄曲霉毒素M1
的定量检测。针对牛奶样品, 该方法的最低检测限1
pg/mL, 批内批间的变异系数均小于9%, 添加回收
率在96%~122%之间。Wang 等[22]基于生物素-亲和素
及胶体金的放大作用, 建立了食品中玉米雌霉烯酮
的化学发光免疫分析方法, 该方法的检测限为0.008
ng/mL, 线性范围为0.02~0.51 ng/mL, 添加回收率在
97%~117%之间。
Yang 等[23]基于碳纳米管技术, 建立了牛奶、苹
果汁和婴儿食品中葡萄球菌肠毒素B(SEB)的化学发
光免疫分析方法, 通过将SEB 抗体包被在碳纳米管
表面, 进一步将包被有SEB 抗体的碳纳米管固定在
聚碳酸酯表面, 最后通过增强化学发光免疫分析方
法测定SEB 含量。在牛奶、苹果汁和婴儿食品中, 该
方法的最低检测限为0.01 ng/mL, 相比于酶联免疫分
析方法, 其最低检测限提高了100 倍。Kijek 等[24]基
于磁性纳米和电化学发光免疫分析方法, 实现了对
食品中葡萄球菌肠毒素B 的检测。该方法的检测灵
敏度为1 pg/mL, 线性范围为0.1~100 ng/mL。Zhang
等[25]基于化学发光酶免疫分析, 建立了水、橙汁、牛
肉、火腿及牛奶中葡萄球菌肠毒素A 的免疫分析方
法, 该方法具有很高的检测灵敏度, 其线性检测范围
为6.4~1600 pg/mL, 最低检出限为3.2 pg/mL。
化学发光免疫分析方法在伏马菌素、黄曲霉毒
素、玉米雌霉烯酮、葡萄球菌肠毒素已得到了较好的
应用, 且具有很好的检测灵敏度, 但仍需开展化学发
第3 期 金茂俊, 等: 化学发光免疫分析方法在食品安全检测中的研究进展 843
光免疫分析体系研究, 进一步提高化学发光免疫分
析方法的稳定性, 更好实现化学发光免疫分析方法
在生物毒素检测方面的应用。
2.3 在违禁添加物检测中的应用
Roda 等[26]基于化学发光酶免疫分析, 建立了克
伦特罗的免疫分析方法, 该方法的检测限为0.08
ng/mL, 变异系数小于10%, 添加回收率在
96%~110%之间。Pou 等[27]基于化学发光酶免疫分析,
建立了沙丁胺醇和克伦特罗的免疫分析方法, 实现
了对猪肝、猪肾及猪肉中两种物质的检测。Han 等[28]
基于时间分辨化学发光技术, 建立了猪尿中克伦特
罗和莱克多巴胺的化学发光免疫分析方法, 所建立
的方法线性检测范围为1.0~500 ng/mL, 检测限
(S/N=2)为0.50 ng/mL。
Choi 等[29]基于化学发光酶免疫分析, 建立了牛
奶中三聚氰胺的免疫分析方法。因牛奶中脂肪会干扰
三聚氰胺及三聚氰胺抗体的免疫反应, 该方法在化
学发光反应体系添加草酰基二咪唑, 以降低脂肪对
免疫反应的干扰。该方法的检测限为6.3 ng/mL, 线
性范围为62.5~2000 ng/mL。
目前建立的克伦特罗、莱克多巴胺及三聚氰胺的
化学发光免疫分析方法, 方法检测限均低于10
ng/mL, 具有很高的检测灵敏度, 可有效满足农产品
质量安全监管的需求, 随着将化学发光免疫分析方
法应用于更多违禁添加物的检测, 将可更加体现该
方法的应用价值。
2.4 在微生物检测中的应用
杨秀岑等[30]基于化学发光酶免疫分析, 建立了
食品中沙门氏菌的免疫分析方法。该方法先将沙门氏
菌固定在聚氯乙烯固相载体上, 再与沙门氏菌抗体
温育1 h, 加入HRP 标记二抗, 利用间接化学发光免
疫法实现对食品中沙门氏菌的快速检测。经对62 份
食品样品进行检测, 将P/N≥3 作为阳性判定标准,
结果符合率达到85.5%。
郭小英等[31]基于化学发光酶免疫分析, 建立了
食品中O157:H7 大肠埃希菌的免疫分析方法。该方
法利用AMPPD-ALP 化学发光反应体系, 通过磁珠
酶联免疫分析法对O157:H7 大肠埃希菌进行检测。
方法检测灵敏度达850 CFU/mL, 线性范围为
1000~50000 CFU/mL, 批间变异系数小于15%, 批内
变异系数小于20%, 与人工计数培养检测结果相比
其相关系数达0.98。Shelton 等[32]基于电化学发光免
疫分析方法, 建立了水中大肠杆菌的检测方法, 该方
法的最低检出限为1000 CFU/mL, 线性范围在
1000~10000 CFU/mL 之间。
基于化学发光免疫分析方法, 实现了对食品中
沙门氏菌、大肠杆菌的检测, 检测结果与人工计数培
养相比有着较高的准确度, 检测灵敏度高, 并可大大
节约检测时间, 基于此, 化学发光免疫分析方法将是
微生物检测很有前途的发展方向。
3 化学发光免疫分析方法的发展方向
化学发光免疫分析方法作为一种具有良好发展
前景的技术, 已在食品安全检测领域得到了较好的
应用。整体而言, 化学发光免疫分析方法相对于传统
的酶联免疫分析方法有着较高的灵敏度, 但其方法
的批内批间变异系数会高于酶联免疫分析方法。其原
因主要是现有的化学发光标记物在发光达到顶峰衰
减后, 其发光值尚不十分稳定。因此, 化学发光免疫
分析方法仍需在以下几方面开展研究。1)继续筛选新
的化学发光标记物; 2)在现有化学发光反应体系中,
开展化学发光增敏体系研究; 3)加强电化学发光免疫
分析方法在食品安全检测领域的应用研究。可以预计,
随着科学家们更多的关注于解决化学发光标记物发
光稳定性问题, 化学发光免疫分析方法在食品安全
领域将得到更为广泛全面的应用。
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(责任编辑:邓伟)
作者简介
金茂俊, 副研究员, 博士, 主要研究
方向为食品安全快速检测技术。
E-mail: katonking@163.com
王静, 教授, 博士, 主要研究方向为
食品安全检测技术。
E-mail: w_jing2001@126.com

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